Notch通路在煙草誘導(dǎo)肺癌發(fā)生中的作用及其分子機(jī)制研究.pdf

1、本文主要講述了以下幾個(gè)方面：
　　第一部分 煙草誘導(dǎo)肺癌發(fā)生模型的建立
　　目的：
　　采用卷煙煙氣凝集物(cigarette smoke condensate，CSC)長(zhǎng)期誘導(dǎo)人永生化人支氣管上皮細(xì)胞株（immortalized human bronchial epithelial cells）BEP2D惡性轉(zhuǎn)化，并接種裸鼠皮下成瘤;同時(shí)利用動(dòng)物吸煙機(jī)建立A/J小鼠煙熏成瘤模型
　　方法：
　　1.利用C

2、SC對(duì)人永生化支氣管上皮細(xì)胞BEP2D持續(xù)進(jìn)行誘導(dǎo)至70代，并用姬姆薩染色觀察細(xì)胞形態(tài)、克隆形成率、生長(zhǎng)曲線、血清抗性實(shí)驗(yàn)、軟瓊脂克隆形成能力對(duì)惡性表型進(jìn)行觀察
　　2.P0、酒精組細(xì)胞（溶媒對(duì)照）、P10、P30、P50、P70細(xì)胞分別加入凋亡誘導(dǎo)劑依托泊苷(Etoposide)，24h后AnnexinⅤ-PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡
　　結(jié)果：
　　隨著染毒代數(shù)的增高，細(xì)胞出現(xiàn)病理性核分裂象，核漿比增大;P30、P40、

3、P50、P60、P70細(xì)胞增殖速度在24h、48h、72h顯著快于正常及酒精對(duì)照組細(xì)胞（P均＜0.05）;P20、P30、P40、P50、P60、P70細(xì)胞克隆形成率明顯高于P0及酒精對(duì)照組細(xì)胞（P均＜0.05）;同P0及酒精對(duì)照組相比，P30、P40、P50、P60、P70細(xì)胞均出現(xiàn)顯著的對(duì)血清促分化能力的抗性（P均＜0.05）;P30、P40、P50、P60、P70細(xì)胞的軟瓊脂克隆形成隨著CSC染毒代數(shù)增高而增高，與P0及酒精對(duì)照組

4、比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）.
　　結(jié)論：
　　惡性表型鑒定和裸鼠成瘤表明CSC成功誘導(dǎo)BEP2D惡性轉(zhuǎn)化，A/J鼠煙熏9月發(fā)生肺癌，為下一步研究煙草致癌機(jī)制提供了理想的體內(nèi)模型.
　　第二部分 Notch通路與吸煙誘導(dǎo)肺癌發(fā)生的相關(guān)性
　　目的：
　　采用人基因表達(dá)譜芯片方法篩選出CSC誘導(dǎo)的惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞差異表達(dá)基因并用Realtime PCR(qPCR)、Western blot和免疫熒光等方

5、法驗(yàn)證;檢測(cè)A/J煙熏小鼠氣道粘膜的Notch通路分子表達(dá);檢測(cè)重度吸煙人群氣道粘膜和肺癌組織中Notch通路分子表達(dá)，分析與吸煙的相關(guān)性，明確Notch通路在吸煙誘導(dǎo)肺癌發(fā)生中的確切作用。
　　方法：
　　1.選取P0和P70細(xì)胞，采用Affymetrix基因表達(dá)譜芯片方法(Gene Chip primeview human)分析差異表達(dá)基因
　　2.根據(jù)基因芯片篩選結(jié)果，運(yùn)用qPCR檢測(cè)P0、酒精組、P10、P30

6、、P50、P70細(xì)胞中17個(gè)Notch通路主要基因:Notch1,Notch2、Notch3、Notch4、JAG1、JAG2、 DLL1, DLL3、Hes1、Hey1、Hey2、HeyL、Hes5、RBPJ、MIB2、DNM1、Numb mRNA表達(dá);根據(jù)Reaitime qPCR結(jié)果，Western blot檢測(cè)上述各代細(xì)胞中Notch1,Notch2、JAG1、JAG2、RBPJ、Hes1、Hey1、Hey2、DNM1、Numb

7、蛋白表達(dá)
　　3免疫熒光法檢測(cè)P0和P70細(xì)胞Notch1,Notch2、JAG1、Hes1、Hey1、Hey2表達(dá)，觀察兩組細(xì)胞熒光表達(dá)強(qiáng)度和蛋白定位.
　　結(jié)果：
　　1.聚類分析顯示P70細(xì)胞中MAPK、P53、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)通路等與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的通路顯著激活，說明轉(zhuǎn)化細(xì)胞具備惡性生物學(xué)特征。同時(shí)發(fā)現(xiàn)多個(gè)Notch通路基因在P70和P0細(xì)胞存在差異表達(dá)（2倍以上差異）
　　2.與P0和酒精組細(xì)胞相比，

8、P70細(xì)胞Notch1、Notch2、Hes1、JAG1、Hes1、Hey1、Hey2、RBPJ mRNA顯著上調(diào)（P均＜0.05）; MIB2、DNM1、Numb mRNA顯著下調(diào)（P均＜0.05）; Notch3、Notch4、DLL1、DLL3、Hes5、HeyL和JAG2 mRNA水平在P0和P70之間無顯著性差異(P均＞0.05);動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞mRNA表達(dá)變化發(fā)現(xiàn): Notch2 mRNA水平CSC誘導(dǎo)早期（P10細(xì)胞）即有顯

9、著上調(diào)，隨后略有下降，在P70細(xì)胞再次升高，多數(shù)Notch通路基因Notch1、Hes1、JAG1、Hes1、Hey1、Hey2、RBPJ在P30細(xì)胞不同程度升高，P70表達(dá)上調(diào)最顯著
　　結(jié)論：
　　煙草激活Notch通路，并與吸煙相關(guān)肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，Notch2上調(diào)可能可能是煙草誘導(dǎo)肺癌發(fā)生的早期分子事件。
　　第三部分 煙草活化Notch通路的分子機(jī)制
　　目的：
　　探討Numb對(duì)Notch

10、2表達(dá)的調(diào)控作用;通過Notch1、Notch2編碼區(qū)基因突變檢測(cè)，分析吸煙對(duì)Notch編碼區(qū)突變發(fā)生頻率的影響
　　方法：
　　1.免疫熒光檢測(cè)P0和P70兩組細(xì)胞中的Notch2和Numb的表達(dá);構(gòu)建Numb過表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-EGFP-Numb(pIRES2-Numb)，通過脂質(zhì)體3000轉(zhuǎn)染P70細(xì)胞，激光共聚焦顯微成像系統(tǒng)觀察Numb、Notch2熒光強(qiáng)度，并計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度值
　　2.通過細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)觀

11、察轉(zhuǎn)染pIRES2-Numb對(duì)P70細(xì)胞克隆形成的影響
　　3.PCR重測(cè)序法檢測(cè)P0、PS0、P70細(xì)胞和34例NSCLC組織標(biāo)本的Notch1、Notch2編碼區(qū)基因突變，比較吸煙組和非吸煙組各個(gè)突變位點(diǎn)的發(fā)生頻率，并用免疫組化方法檢測(cè)突變頻率有差異的NSCLC組織中Hes1表達(dá)
　　結(jié)果：
　　1.P70細(xì)胞中Notch2蛋白的熒光強(qiáng)度顯著高于P0，P0細(xì)胞中Numb蛋白的熒光強(qiáng)度顯著高于P70細(xì)胞。與空質(zhì)粒(p

12、IRES2)組相比，pIRES2-Numb顯著增加了Notch2蛋白的相對(duì)熒光強(qiáng)度值（P＜0.01）
　　2.pIRES2-Numb組細(xì)胞克隆形成數(shù)顯著低于pIRES2組(P＜0.01)
　　3.通過Notch1編碼區(qū)測(cè)序分析，在外顯子3、14、27和34共發(fā)現(xiàn)5種SNPs,均為同義突變::rs10521(p.Asp1698=)、rs2229971(p.Asn755=)，rs2229974(p.Asp2185=),rs381

13、2596(p.Pro2216=), rs4489420(p.Asn104=)。吸煙NSCLC患者平均每例Notch1編碼區(qū)發(fā)生SNP的數(shù)量是3.00±1.00，高于非吸煙患者的1.13±0.83(P＜0.01)，比較吸煙組和非吸煙組每個(gè)SNPs的發(fā)生率，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fisher精確概率法P＞0.05)。P70細(xì)胞Notch2編碼區(qū)檢測(cè)到7個(gè)SNPs(c.57C＞G、c.710G＞A、c.5065A＞T、c.7042T＞C、c.32

14、34C＞T、c.572A＞T和c.2882G＞A)，頻率高于P50細(xì)胞(c.57C＞G、c.710G＞A、c.3234C＞T和c.572A＞T)和P0細(xì)胞(c.57C＞G和c.2622T＞C)
　　結(jié)論：
　　Numb負(fù)調(diào)控失調(diào)和Notch編碼區(qū)突變可能是煙草誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵分子機(jī)制。
　　第四部分 Notch通路促進(jìn)人永生化支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的作用及其分子機(jī)制
　　目的：
　　通過體

15、內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)Notch通路是否具有促進(jìn)煙草誘導(dǎo)肺癌發(fā)生的作用，并比較Notch1和Notch2在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的不同作用;探討Notch通路促進(jìn)煙草誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制
　　方法：
　　1.構(gòu)建慢病毒shRNA-Notch1(Notch1-KD)和shRNA-Notch2(Notch2-KD)載體，并感染P70細(xì)胞，qPCR檢測(cè)干擾效率，MTT和細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞增殖和細(xì)胞克隆的變化
　　2.Not

16、ch1過表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-EGFP-Notch1(pIRES2-Notch1)、Notch2過表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-EGFP-Notch2(pIRES2-Notch2)分別轉(zhuǎn)染P0細(xì)胞，Western blot檢測(cè)Notch1和Notch2表達(dá)，MTT和細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞增殖和細(xì)胞克隆的變化
　　結(jié)果：
　　Notch1-KD敲減效率75.3％，Notch2-KD敲減效率83.6％，干擾效率較好，可以滿足后續(xù)功能學(xué)實(shí)驗(yàn)