Notch通路在電針預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血保護(hù)中的作用研究.pdf

1、隨著我國(guó)人口老齡化日益嚴(yán)重，缺血性腦卒中已成為危害人民群眾健康的致命殺手。在缺血性腦卒中的治療中，無(wú)論是溶栓還是動(dòng)脈介入治療，目的都是使閉塞的腦動(dòng)脈再通，恢復(fù)梗死區(qū)的血液供應(yīng)，而再灌注過(guò)程往往加重組織細(xì)胞功能、代謝障礙及結(jié)構(gòu)破壞，即出現(xiàn)再灌注損傷。尋找有效的細(xì)胞保護(hù)方法，防治腦缺血/再灌注損傷，促進(jìn)腦卒中后中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能重建，一直是腦缺血保護(hù)研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。1990年Kitagawa等首先提出了腦缺血預(yù)處理的概念，研究證實(shí)，缺

2、血預(yù)處理是一種療效肯定的具有腦缺血保護(hù)效應(yīng)的預(yù)防手段，但這種預(yù)處理方法因其有創(chuàng)性難以直接應(yīng)用于臨床。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)重復(fù)電針刺激大鼠“百會(huì)”穴預(yù)處理，可模擬缺血預(yù)處理的腦保護(hù)效應(yīng)，誘導(dǎo)“腦缺血耐受”，但確切機(jī)制尚不完全清楚。Notch信號(hào)通路最初是在研究果蠅神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的，該通路涉及發(fā)育過(guò)程中的多個(gè)決定點(diǎn)，調(diào)控大腦發(fā)育過(guò)程中神經(jīng)干細(xì)胞的存活和凋亡。新近研究發(fā)現(xiàn)，成年大腦缺血損傷后Notch通路也被激活，Notch通路的激活可以促進(jìn)

3、缺血后神經(jīng)干細(xì)胞的存活。盡管現(xiàn)有證據(jù)顯示電針腦保護(hù)作用與PI3K/Akt和JAK/STAT通路活化有關(guān)；以及Notch通路激活可通過(guò)活化PI3K/Akt，并與JAK/STAT相互作用，調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞的存活、分化及缺血性腦損傷后的神經(jīng)修復(fù)。但至今尚不清楚Notch通路是否參與電針預(yù)處理誘導(dǎo)的腦缺血耐受效應(yīng)及發(fā)揮何種作用。本研究采用大鼠大腦中動(dòng)脈阻閉（MiddleCerebralArteryOcclusion，MCAO）模型，利用分子生物學(xué)

4、和形態(tài)學(xué)研究技術(shù)，觀察缺血再灌注前后對(duì)照組及電針預(yù)處理組不同腦區(qū)中Notch通路的活性變化，證實(shí)Notch信號(hào)通路是否參與了電針預(yù)處理誘導(dǎo)的腦缺血耐受效應(yīng)，并初步探討其在電針預(yù)處理腦保護(hù)效應(yīng)中的作用。本研究分三部分：第一部分為電針預(yù)處理對(duì)不同腦區(qū)Notch通路活性的影響，目的是研究電針預(yù)處理對(duì)缺血再灌注前不同腦區(qū)Notch通路活化的特點(diǎn)；第二部分為電針預(yù)處理對(duì)缺血再灌注后紋狀體中Notch通路活性的影響，目的是研究電針預(yù)處理對(duì)缺血再灌注

5、后紋狀體中Notch通路活化的特點(diǎn)。第三部分為阻斷Notch通路激活對(duì)電針預(yù)處理誘導(dǎo)的腦缺血耐受效應(yīng)的影響，目的是研究Notch通路是否參與電針預(yù)處理誘導(dǎo)的腦缺血耐受效應(yīng)，及發(fā)揮何種作用。
　　第一部分電針預(yù)處理對(duì)不同腦區(qū)Notch通路活性的影響
　　方法
　　1.電針預(yù)處理對(duì)Notch通路相關(guān)分子mRNA含量影響
　　清潔級(jí)雄性SD大鼠18只（280-320g），隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組（Sham）、對(duì)照組（CO

6、N）和電針預(yù)處理組（EA），EA組動(dòng)物連續(xù)電針預(yù)處理5天，分別于第一次預(yù)處理后2h和最后一次預(yù)處理后24h處死，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)，檢測(cè)電針預(yù)處理后相關(guān)分子（Notch1、Notch4、Jag1、Hes1、Hes5）mRNA含量變化。
　　2.電針預(yù)處理對(duì)不同腦區(qū)蛋白質(zhì)NICD含量影響
　　清潔級(jí)雄性SD大鼠18只（280-320g），分組同1，分別于第一次預(yù)處理后2h和最后一次預(yù)處理后24h處死，進(jìn)行蛋白免

7、疫印跡(Westernblotting)。
　　結(jié)果
　　1．電針預(yù)處理對(duì)缺血再灌注前不同腦區(qū)Notch信號(hào)通路相關(guān)分子mRNA的影響
　　RT-PCR檢測(cè)大鼠海馬及紋狀體中Notch1、Notch4、Jag1、Hes1、Hes5基因發(fā)現(xiàn)，單次電針預(yù)處理后2h，EA組紋狀體中Notch1和Notch4基因表達(dá)明顯高于Sham組及CON組（P<0.05），Jag1、Hes1和Hes5基因表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而海馬中各種基因

8、表達(dá)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。重復(fù)電針預(yù)處理5d后間隔24h，EA組紋狀體中Notch1、Notch4和Jag1基因表達(dá)明顯高于Sham組及CON組（P<0.05），Hes1和Hes5基因表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而海馬中Notch信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2．電針預(yù)處理后不同腦區(qū)蛋白質(zhì)NICD的含量變化
　　Westernblotting顯示，單次電針預(yù)處理后2h和重復(fù)電針預(yù)處理5d后間隔24h，EA組海馬及紋狀體中NICD

9、的含量與Sham組及CON組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　第二部分電針預(yù)處理對(duì)缺血再灌注后紋狀體中Notch通路活性的影響
　　方法
　　1．缺血再灌注后紋狀體中蛋白質(zhì)NICD的含量變化
　　清潔級(jí)雄性SD大鼠24只（280-320g），隨機(jī)分為2組：對(duì)照組（CON）和電針預(yù)處理組（EA），EA組動(dòng)物連續(xù)電針預(yù)處理5天，于最后一次預(yù)處理后24h行大腦中動(dòng)脈阻閉（MCAO）模型，經(jīng)歷2h缺血。動(dòng)物分別于MCAO前及再灌

10、注（I/R）2h、24h和72h處死，進(jìn)行蛋白免疫印跡(Westernblotting)，檢測(cè)缺血再灌注后紋狀體中蛋白質(zhì)NICD的含量變化。
　　2．電針預(yù)處理后NICD陽(yáng)性細(xì)胞的分布和細(xì)胞定位
　　雄性SD大鼠6只，分組同1。再灌注24h后將動(dòng)物處死，進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)染色及細(xì)胞計(jì)數(shù)。
　　3．缺血再灌注后紋狀體中Hes1及Hes5基因表達(dá)變化
　　清潔級(jí)雄性SD大鼠24只（280-320g），分組及處理方法同1

11、。動(dòng)物經(jīng)歷2h缺血，分別于MCAO前及再灌注2h、24h和72h處死，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)，檢測(cè)缺血再灌注后紋狀體中Hes1及Hes5基因mRNA的含量變化。
　　結(jié)果
　　1．電針預(yù)處理增加缺血再灌注早期紋狀體中NICD的含量
　　NICD作為Notch通路活化的標(biāo)志，缺血再灌注后2h及24h，EA組紋狀體中NICD明顯高于CON組(P<0.05)，EA組NICD含量于I/R2h開始升高，I/R24h達(dá)

12、高峰，隨后逐漸下降；CON組再灌注后NICD持續(xù)升高，于再灌注后72h達(dá)高峰，明顯高于EA組(P<0.05)；缺血再灌注前，EA組與CON組NICD含量比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.35)。
　　免疫熒光雙標(biāo)染色發(fā)現(xiàn)，再灌注后24h缺血側(cè)紋狀體中，EA組Notch1NICD陽(yáng)性細(xì)胞明顯多于CON組，EA組NICD與NEUN雙標(biāo)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)也明顯多于CON組（P<0.05）。
　　2．電針預(yù)處理增加缺血再灌注早期紋狀體中Hes1及

13、Hes5基因表達(dá)
　　RT-PCR檢測(cè)Hes1及Hes5基因發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注后2h及24h，EA組Hes1基因表達(dá)明顯高于CON組（P<0.05），EA組Hes1基因表達(dá)于I/R2h最高，隨后逐漸下降，于再灌注后72h低于CON組（P<0.05）；缺血再灌注后24h及72h，EA組Hes5基因表達(dá)明顯高于CON組（P<0.05）；缺血再灌注前，EA組與CON組中Hes1及Hes5基因mRNA含量比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　第三部

14、分阻斷Notch通路激活對(duì)電針預(yù)處理誘導(dǎo)的腦缺血耐受效應(yīng)的影響
　　方法
　　1.側(cè)腦室注射MW167對(duì)電針預(yù)處理后Notch通路活化的影響
　　清潔級(jí)雄性SD大鼠6只（280-320g），隨機(jī)分為2組：電針預(yù)處理組（EA）和MW167+電針預(yù)處理組（EA+MW167），動(dòng)物經(jīng)歷連續(xù)5天30min電針預(yù)處理，最后一次預(yù)處理后24h行大腦中動(dòng)脈阻閉（MCAO）模型。EA+MW167組動(dòng)物于MCAO前30min行側(cè)腦室注射

15、γ-分泌酶抑制劑MW167。動(dòng)物經(jīng)歷2h缺血，于再灌注后24h處死，進(jìn)行蛋白免疫印跡(Westernblotting)，檢測(cè)缺血再灌注后紋狀體中蛋白質(zhì)NICD的含量變化。
　　2.γ-分泌酶抑制劑MW167對(duì)腦缺血耐受效應(yīng)的影響
　　清潔級(jí)雄性SD大鼠48只（280-320g），隨機(jī)分為6組：假手術(shù)組（Sham），對(duì)照組（CON），電針預(yù)處理組(EA)，γ-分泌酶抑制劑組（MW167），電針預(yù)處理+γ-分泌酶抑制劑MW167

16、組(EA+MW167)，電針預(yù)處理+溶劑組(EA+DMSO)。電針預(yù)處理及腦室注射方法同1，動(dòng)物經(jīng)歷2h缺血，分別于I/R24h、48h和72h行Garcia神經(jīng)功能障礙評(píng)分。I/R72h處死動(dòng)物，TTC染色測(cè)定腦梗死容積。
　　結(jié)果
　　1.側(cè)腦室注射γ-分泌酶抑制劑MW167有效阻斷Notch通路激活
　　Westernblotting顯示，I/R24h，EA+MW167組紋狀體中NICD含量明顯低于EA組(P<0

17、.05)，證實(shí)MW167（濃度為1mM）有效阻斷Notch信號(hào)通路激活。
　　2.γ-分泌酶抑制劑MW167拮抗電針預(yù)處理所誘導(dǎo)腦缺血耐受效應(yīng)
　　EA組、EA+DMSO組及MW167組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)NDS評(píng)分明顯優(yōu)于對(duì)照組，而EA組及EA+DMSO組NDS評(píng)分又明顯優(yōu)于MW167組。
　　再灌注72h后，CON組腦梗死容積明顯大于EA組，EA+MW167組腦梗死容積也明顯大于EA組；而EA+MW167組與CON組腦梗死

18、容積差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.056)；EA+DMSO組與EA組腦梗死容積差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.98)。
　　結(jié)論
　　1.缺血再灌注前，電針預(yù)處理可以增加紋狀體中Notch通路的受體（Notch1和Notch4）和配體（Jag1）表達(dá)，但并未升高NICD的含量，故可認(rèn)為其并未直接激活Notch通路。缺血再灌注后，電針預(yù)處理使紋狀體中Notch通路在缺血再灌注早期激活，并較單純?nèi)毖崆斑_(dá)峰。
　　2.阻斷Not