GLT-1在間歇低壓缺氧預(yù)處理及腦缺血預(yù)處理中的作用.pdf

1、腦缺血耐受(brain ischemic tolerance，BIT)是指器官或組織經(jīng)受一次或多次短暫的缺血發(fā)生后，可激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，從而減輕后續(xù)腦缺血引起的損傷。近年來研究發(fā)現(xiàn)不僅是缺血，其他多種預(yù)處理方式如低氧、高溫、化學(xué)藥物等也可誘導(dǎo)腦組織對缺血損傷的耐受。本文分別通過間歇性低壓缺氧預(yù)處理、腦缺血預(yù)處理兩種方式誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生腦缺血耐受，探討GLT-1在其中是否發(fā)揮作用。
　　間歇性低壓缺氧(Intermittent

2、 hypobaric hypoxia，IH)處理常常用來治療和預(yù)防多種疾病，如高血壓、冠心病、帕金森氏病和急性髓性白血病，而關(guān)于其治療機(jī)制的研究正在進(jìn)行，例如有報道稱，IH預(yù)處理可以促進(jìn)成年大鼠海馬神經(jīng)元的形成，發(fā)揮明顯的抗抑郁類效應(yīng)，而且間歇性暴露在低氧環(huán)境中其血清促紅細(xì)胞生成素的表達(dá)量可以顯著上調(diào)，此外IH預(yù)處理還可顯著降低嚴(yán)重乏氧性缺氧打擊后大鼠海馬和新皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元的凋亡，減少行為異常和學(xué)習(xí)記憶能力的損害?；谏鲜鲎C據(jù)，提示IH預(yù)

3、處理可以誘導(dǎo)腦缺血耐受，但其機(jī)制尚不明了。我們前期的研究已證實膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運體-1(glial glutamate transporter-1，GLT-1)，其為中樞神經(jīng)系統(tǒng)最重要的谷氨酸轉(zhuǎn)運體之一，參與整體情況下腦缺血預(yù)處理所誘導(dǎo)的腦缺血耐受；GLT-1的高表達(dá)參與海馬CA3區(qū)和齒狀回固有的缺血耐受。因此，我們推測，IH預(yù)處理有可能通過上調(diào)GLT-1表達(dá)誘導(dǎo)腦缺血耐受。本實驗的目的在于探討GLT-1在IH預(yù)處理誘導(dǎo)的腦缺血耐受中是

4、否發(fā)揮作用，從而為將來腦缺血性疾病的防治提供實驗依據(jù)。
　　在腦缺血缺氧性損傷時，GLT-1的攝取功能會一過性降低，導(dǎo)致細(xì)胞外谷氨酸濃度明顯升高，同時在海馬可伴有天冬氨酸濃度的升高。抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用，如中風(fēng)后γ-氨基丁酸的持續(xù)高濃度減弱了缺血后腦組織的損傷。本實驗通過腦缺血預(yù)處理的方式誘導(dǎo)腦缺血耐受，聯(lián)合應(yīng)用微透析技術(shù)與高效液相色譜技術(shù)，觀察在腦缺血耐受誘導(dǎo)過程中腦內(nèi)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的變化，預(yù)先側(cè)腦室

5、注射GLT-1的特異性抑制劑DHK抑制GLT-1的功能，觀察對上述過程中氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的影響，則可以有效地反應(yīng)GLT-1的功能變化，為進(jìn)一步確認(rèn)GLT-1參與腦缺血耐受誘導(dǎo)提供證據(jù)。
　　PPARγ通路被廣泛認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自我防御體系，參與減弱腦缺血再灌注的損傷，并發(fā)揮內(nèi)源性保護(hù)作用。GLT-1是PPARγ的一個靶基因，PPARγ的激動劑羅格列酮能夠引起GLT-1mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)，同時能夠減輕嚴(yán)重氧葡萄糖剝奪所引起的

6、神經(jīng)元死亡和谷氨酸釋放。推測，CIP可能通過PPARγ上調(diào)GLT-1的表達(dá)減弱缺血再灌注損傷。本室前期研究證明，CIP通過p38 MAPK介導(dǎo)GLT-1蛋白表達(dá)的上調(diào)而誘導(dǎo)腦缺血耐受，而核轉(zhuǎn)錄因子-kappa B(nuclear factor kappa B，NF-κB)正是p38 MAPK的下游信號分子之一。大量研究證明，NF-κB參與調(diào)控GLT-1的表達(dá)并在腦缺血時發(fā)揮重要作用，例如Ghosh等發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元通過NF-κB調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)

7、胞的GLT-1轉(zhuǎn)錄，Tai等證實阿米替林通過NF-κB引起嗎啡慢性鞘內(nèi)注射大鼠GLT-1及GLAST的表達(dá)上調(diào)。推測，CIP可能通過NF-κB上調(diào)GLT-1表達(dá)減弱缺血再灌注損傷?；谝陨峡紤]，我們預(yù)先分別經(jīng)側(cè)腦室注射PPARγ的特異性拮抗劑GW9662及NF-κB的特異性拮抗劑BAY11-7082，通過動態(tài)觀察海馬CA1區(qū)谷氨酸、天冬氨酸和γ-氨基丁酸等神經(jīng)遞質(zhì)濃度的變化，探討GLT-1在腦缺血耐受中是否被PPARγ、NF-κB信號通

8、路調(diào)控。
　　1、IH預(yù)處理通過上調(diào)GLT-1表達(dá)誘導(dǎo)腦缺血耐受
　　1.1方法：健康雄性Wistar大鼠(180-220g)57只，隨機(jī)用于以下三部分研究：
　　1.1.1 IH預(yù)處理后GLT-1和GFAP的基礎(chǔ)表達(dá)
　　將12只永久凝閉椎動脈的Wistar大鼠隨機(jī)分為兩組(n=6)：(1)sham組：即假術(shù)組，只暴露雙側(cè)頸總動脈，不阻斷血流；(2)IH+sham組：IH預(yù)處理28 d后，行假手術(shù)，即只暴露雙側(cè)

9、頸總動脈，不阻斷血流。以上各組大鼠在假手術(shù)后即刻斷頭取材，各組分別取3只動物用于免疫組織化學(xué)，檢測GLT-1和GFAP的表達(dá)；其余3只用于Western blot分析GLT-1的表達(dá)。
　　1.1.2 IH預(yù)處理后全腦缺血大鼠GLT-1的表達(dá)
　　將24只永久凝閉椎動脈的Wistar大鼠隨機(jī)分為4組(n=6)：(1)sham組；(2)IH+sham組；(3)損傷性缺血組：夾閉雙側(cè)頸總動脈8 min造成全腦缺血，然后恢復(fù)血流再

10、灌注；(4)IH+損傷性缺血組：IH預(yù)處理28 d后，夾閉雙側(cè)頸總動脈8 min造成全腦缺血，然后恢復(fù)血流再灌注。以上各組大鼠在損傷性腦缺血或假手術(shù)后7 d斷頭取材，分別應(yīng)用免疫組織化學(xué)和Western blot檢測GLT-1蛋白的表達(dá)。
　　1.1.3 DHK對IH預(yù)處理誘導(dǎo)的腦缺血耐受的影響
　　將21只永久凝閉椎動脈的Wistar大鼠隨機(jī)分為7組(n=3)：(1)sham組；(2)IH+sham組；(3)損傷性缺血組；

11、(4)IH+損傷性缺血組；(5)DHK+sham組：sham手術(shù)前30 min通過右側(cè)腦室注射200 nmol DHK，然后進(jìn)行假手術(shù)；(6)aCSF+IH+損傷性缺血組：首先進(jìn)行IH預(yù)處理28 d后，全腦缺血前30 min通過右側(cè)腦室注射15μl aCSF，然后進(jìn)行8 min全腦缺血；(7)DHK+IH+損傷性缺血組：首先進(jìn)行IH預(yù)處理28 d后，全腦缺血前30 min通過右側(cè)腦室注射200 nmol DHK，然后進(jìn)行8 min全腦缺

12、血。以上各組大鼠在損傷性腦缺血或假手術(shù)后7 d斷頭取材，硫堇染色進(jìn)行神經(jīng)病理學(xué)評價，觀察大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的存活狀況。
　　1.2結(jié)果：
　　1.2.1 IH預(yù)處理上調(diào)GLT-1的基礎(chǔ)表達(dá)
　　通過免疫組織化學(xué)染色觀察sham組即刻時間點GLT-1的表達(dá)，即GLT-1的基礎(chǔ)表達(dá)，可見海馬CA1區(qū)GLT-1陽性標(biāo)記物染色較淺、呈棕黃色，彌散性分布。與sham組相比，IH+sham組海馬CA1區(qū)的GLT-1陽性標(biāo)記物明

13、顯上調(diào)，尤其在錐體神經(jīng)元之間分布更密集。
　　通過Western Blot觀察IH預(yù)處理對GLT-1基礎(chǔ)表達(dá)的影響，與sham組即刻時間點相比，IH+sham組即刻時間點海馬CA1區(qū)GLT-1蛋白的表達(dá)水平顯著升高。
　　綜合免疫組化和Western Blot結(jié)果，一致認(rèn)為IH預(yù)處理上調(diào)了海馬CA1區(qū)GLT-1的基礎(chǔ)表達(dá)。
　　1.2.2 IH預(yù)處理上調(diào)GFAP的基礎(chǔ)表達(dá)
　　通過免疫組織化學(xué)染色觀察GFAP的表

14、達(dá)，可見海馬CA1區(qū)存在散在分布的、棕黃色、呈星狀的星形膠質(zhì)細(xì)胞，具有較多突起。Sham組即刻時間點錐體神經(jīng)元周圍分布少量的GFAP陽性顆粒。IH+sham組即刻時間點CA1區(qū)GFAP陽性顆粒顯著增多，即星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目明顯增多，其胞體大小正常，突起豐富細(xì)長，并緊緊包繞著錐體神經(jīng)元。表明，IH預(yù)處理上調(diào)GFAP的基礎(chǔ)表達(dá)。
　　1.2.3 IH預(yù)處理阻斷損傷性腦缺血導(dǎo)致的GLT-1表達(dá)下調(diào)
　　應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色觀察各組大

15、鼠7 d時間點GLT-1的表達(dá)。sham組大鼠海馬CA1區(qū)GLT-1免疫顆粒染色較淺、彌散性分布。與sham組相比，IH+sham組GLT-1免疫陽性顆粒顯著增加。與sham組相比，損傷性缺血組海馬CA1區(qū)在8 min缺血后GLT-1的表達(dá)顯著降低，尤其在錐體神經(jīng)元全部死亡的區(qū)域及其周圍區(qū)域。但是當(dāng)預(yù)先給予了28 d的IH預(yù)處理，然后再進(jìn)行8 min全腦缺血，結(jié)果發(fā)現(xiàn)海馬CA1區(qū)的GLT-1表達(dá)沒有明顯降低，即IH預(yù)處理顯著阻斷了損傷性

16、缺血造成的GLT-1下調(diào)。
　　通過Western Blot觀察各組大鼠7 d時間點GLT-1的表達(dá)。IH+sham組海馬CA1區(qū)蛋白的表達(dá)量明顯高于sham組。而與sham組相比，損傷性缺血組7 d時間點在8 min缺血后GLT-1的表達(dá)顯著減少。但是當(dāng)預(yù)先給予了28 d的IH預(yù)處理，然后再進(jìn)行8 min全腦缺血，結(jié)果發(fā)現(xiàn)海馬CA1區(qū)的GLT-1表達(dá)沒有明顯降低，即IH預(yù)處理顯著阻斷了8 min全腦缺血造成的GLT-1表達(dá)下調(diào)。

17、
　　綜合免疫組化和Western Blot分析的結(jié)果，一致認(rèn)為IH預(yù)處理阻斷了8 min全腦缺血造成的GLT-1表達(dá)下調(diào)。
　　1.2.4 DHK阻斷了IH誘導(dǎo)的腦缺血耐受
　　通過硫堇染色觀察各組大鼠7 d時間點海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的遲發(fā)性死亡狀況。sham組大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元排列整齊、致密，共2-3層，細(xì)胞形態(tài)完整、邊界清晰、尼氏小體豐富，胞核大而圓、核仁清晰。組織學(xué)分級(HG)為0級，神經(jīng)元密度(ND

18、)為203.53±11.04。IH+sham組7 d時間點沒有觀察到明顯的神經(jīng)元損傷。然而，損傷性缺血組在8 min全腦缺血后7 d觀察到大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元明顯的DND，表現(xiàn)為幾乎全部神經(jīng)元死亡，殘存的神經(jīng)元胞體皺縮，呈多角形或梭形，胞核固縮、濃染，核仁不清或消失。IH+損傷性缺血組CA1區(qū)錐體神經(jīng)元排列整齊、致密，胞核飽滿、核仁較清晰，僅見個別錐體細(xì)胞核固縮，無明顯的細(xì)胞缺失，與損傷性缺血組相比，HG明顯降低，ND明顯增加。提

19、示：28 d的IH預(yù)處理可以明顯抑制8 min全腦缺血造成的DND，即IH預(yù)處理成功誘導(dǎo)了海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的缺血耐受。在DHK+sham組，注射200 nmol DHK后海馬CA1區(qū)僅見輕微的DND，證明此劑量的DHK并不會對錐體神經(jīng)元造成致命損害。aCSF+IH+損傷性缺血組無明顯的DND。然而，DHK+IH+損傷性缺血組可見顯著地DND，即幾乎全部神經(jīng)元死亡，其ND明顯降低，HG明顯增加。
　　綜上表明，提前給予200

20、nmol DHK可以顯著抑制IH預(yù)處理誘導(dǎo)的腦缺血耐受。
　　2、GLT-1對腦缺血耐受大鼠海馬CA1區(qū)氨基酸濃度的影響及其分子機(jī)制
　　2.1方法：健康雄性Wistar大鼠(280-300 g)35只，預(yù)先于頭部埋置雙管，恢復(fù)5 d后，隨機(jī)分為以下7組：
　　(1)sham組：水合氯醛腹腔注射麻醉，永久凝閉雙側(cè)椎動脈，再暴露頸總動脈并埋置雙線。2 d后進(jìn)行微透析，不阻斷血流，將穿過的線抽出。
　　(2)CIP組

21、：永久凝閉雙側(cè)椎動脈，然后頸總動脈埋置雙線。2 d后進(jìn)行微透析時勒緊雙線造成缺血，時間為3 min。然后將勒緊的線完全松開并抽出，以恢復(fù)血流再灌注。
　　(3)損傷性缺血組：實驗流程同CIP組，但缺血時間為8 min。
　　(4)CIP+損傷性缺血組：首先永久凝閉雙側(cè)椎動脈。2 d后行CIP實驗，當(dāng)日頸總動脈埋置雙線。2 d后進(jìn)行微透析時再勒緊雙線進(jìn)行8 min缺血，后恢復(fù)血流再灌注。
　　(5)DHK+CIP+損傷性

22、缺血組：基本流程同(4)組。DHK溶液(200
　　nmol，20μl)于微透析時8 min缺血前30 min注射入側(cè)腦室。
　　(6)GW9662+CIP+損傷性缺血組：基本流程同(4)組。GW9662(2.5
　　nmol，25μl)分別于CIP前30 min和CIP后6 h注射入側(cè)腦室。
　　(7)BAY11-7082+CIP+損傷性缺血組：基本流程同(4)組。BAY11-7082(2.5 nmol，25μ

23、l)分別于CIP前30 min和CIP后6 h注射入側(cè)腦室。
　　收集上述各組的海馬CA1區(qū)透析液，-80℃保存。然后進(jìn)行高效液相色譜的熒光檢測，觀察其透析液中谷氨酸，天冬氨酸和γ-氨基丁酸的濃度隨腦缺血處理的變化。
　　2.2結(jié)果：
　　2.2.1谷氨酸濃度在各組的變化
　　在sham組，假手術(shù)中及其前后谷氨酸濃度基本不變。CIP組中，3 min缺血引起了谷氨酸濃度的升高，平均可達(dá)基礎(chǔ)濃度的1.7倍。在8 mi

24、n損傷性腦缺血組中，缺血開始即有谷氨酸濃度的升高，并迅速升至基礎(chǔ)值的7倍左右，在恢復(fù)血流再灌注后迅速下降，于4 min左右恢復(fù)至基礎(chǔ)水平。在CIP+損傷性缺血組，谷氨酸在8 min缺血后平均升高為基礎(chǔ)值的3.9倍，此幅度明顯低于8 min損傷性缺血組。與CIP+損傷性缺血組相比，3個打藥組的谷氨酸濃度均有顯著升高。DHK+CIP+損傷性缺血組，8 min缺血開始后迅速升至基礎(chǔ)濃度的6倍左右，恢復(fù)血流再灌注后迅速下降，于4 min左右降至

25、基礎(chǔ)水平。GW9662和BAY11-7082組谷氨酸的變化趨勢與DHK組相似，峰值分別達(dá)基礎(chǔ)濃度的5.6和4.8倍。
　　2.2.2天冬氨酸濃度在各組的變化
　　在sham組，假手術(shù)中及其前后天冬氨酸濃度基本不變。CIP和損傷性缺血組天冬氨酸濃度的變化趨勢和谷氨酸相似，峰值分別達(dá)基礎(chǔ)濃度的2和4.8倍。不同的是，CIP+損傷性缺血組天冬氨酸峰值為基礎(chǔ)濃度的5倍，與損傷性缺血組相比無顯著差異。在DHK+CIP+損傷性缺血組、G

26、W9662+CIP+損傷性缺血組和BAY11-7082+CIP+損傷性缺血組，天冬氨酸濃度的峰值分別是基礎(chǔ)水平的4.5、4.8、4.6倍。
　　2.2.3γ-氨基丁酸(GABA)的濃度在各組的變化
　　sham組，假手術(shù)中及其前后GABA的濃度基本不變。CIP組和損傷性缺血組的GABA濃度有明顯升高，分別可達(dá)基礎(chǔ)水平的3.5和8倍，其變化趨勢與谷氨酸相似。但是在CIP+損傷性缺血組，可見GABA濃度迅速升高，峰值達(dá)到基礎(chǔ)值的

27、20倍，提示提前2 d的CIP引起了損傷性缺血后更顯著的GABA升高。三個打藥組在損傷性缺血后同樣出現(xiàn)GABA的顯著升高，與CIP+損傷性缺血組相比，無明顯差異。
　　結(jié)論
　　1、IH預(yù)處理上調(diào)GLT-1的基礎(chǔ)表達(dá)，8 min全腦缺血使GLT-1的蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，而提前給予28 d的IH預(yù)處理阻斷8 min缺血導(dǎo)致的GLT-1表達(dá)下調(diào)。DHK通過下調(diào)GLT-1功能阻斷IH預(yù)處理誘導(dǎo)的腦缺血耐受。綜上表明，IH預(yù)處理通過上

28、調(diào)GLT-1的表達(dá)誘導(dǎo)腦缺血耐受。
　　2、CIP顯著抑制8 min缺血后的谷氨酸濃度升高，此作用可被GLT-1的抑制劑DHK阻斷，說明CIP可通過增強GLT-1對谷氨酸的攝取誘導(dǎo)腦缺血耐受。CIP誘導(dǎo)的腦缺血耐受也可被GW9662、BAY11-7082阻斷，說明CIP通過PPARγ、NF-κB信號通路上調(diào)GLT-1對谷氨酸的轉(zhuǎn)運，誘導(dǎo)腦缺血耐受。
　　3、天冬氨酸和GABA在缺血時也升高，提前2 d的CIP對8 min缺血