TIP30在肺癌組織中的表達(dá)及其抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的體外研究.pdf

1、肺癌是當(dāng)今世界上發(fā)病率增長(zhǎng)最快和死亡率最高的惡性腫瘤。然而由于肺癌發(fā)病隱匿、惡性程度高、發(fā)展迅速,80％的肺癌患者就診時(shí)已處于進(jìn)展期。目前,僅有20％-30％的患者得到早期診斷。盡管采用手術(shù)、放療和化療等綜合治療措施,由于腫瘤轉(zhuǎn)移和多藥耐藥,總的5年生存率仍低于15％。因此,深入研究肺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制,尋找更加有效的診斷和治療方法是肺癌研究中迫切需要解決的重要課題。大量研究表明,肺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移是一個(gè)多因素、多步驟和多基因參與的復(fù)雜過(guò)

2、程,這期間基因突變、原癌基因激活、抑癌基因失活及其導(dǎo)致一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的異常等分子病理學(xué)改變貫穿了肺癌病變的全過(guò)程。篩選出高靈敏性,高特異性的腫瘤標(biāo)記物,從分子水平輔助肺癌的早期診斷,監(jiān)測(cè)肺癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后,進(jìn)行靶向性腫瘤生物治療,具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。 TiP30,又稱CC3,是一種新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因,最早是通過(guò)RNA差異顯示技術(shù)比較高轉(zhuǎn)移性小細(xì)胞肺癌(v-SCLC)和低轉(zhuǎn)移性小細(xì)胞肺癌(c-SCLC)mRNA時(shí)發(fā)現(xiàn)的。近

3、年來(lái)的研究表明,TIP30在多種正常組織中表達(dá),在黑色素瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、惡性膠質(zhì)細(xì)胞瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌和肝細(xì)胞癌等多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)。早期的研究發(fā)現(xiàn)TIP30具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖,抑制腫瘤血管生成,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡等作用。TIP30基因的突變體具有了癌基因的功能,并且TIP30敲除老鼠可自發(fā)生成多種腫瘤,并導(dǎo)致乳腺導(dǎo)管細(xì)胞的癌前轉(zhuǎn)化。 早期的研究表明,TIP30缺失的小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株比表達(dá)TIP30的細(xì)胞對(duì)死亡信號(hào)(無(wú)生長(zhǎng)因子

4、、放化療藥物等)的耐受能力更強(qiáng),并且將TIP30基因轉(zhuǎn)入高轉(zhuǎn)移性小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株(TIP30表達(dá)缺失)明顯地抑制了細(xì)胞的增殖能力,增加了細(xì)胞對(duì)死亡刺激信號(hào)的敏感性,并抑制腫瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移,證明TIP30在小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。 但是,TIP30在肺癌組織中的表達(dá)及其與臨床指標(biāo)的相關(guān)性尚未見(jiàn)報(bào)道。成功制備了高純度高特異性TIP30多克隆抗體,利用組織芯片結(jié)合免疫組化技術(shù)檢測(cè)206例肺癌及癌旁組織和部分

5、轉(zhuǎn)移灶中TIP30的表達(dá),分析TIP30表達(dá)與多項(xiàng)臨床指標(biāo)的相關(guān)性及其與患者預(yù)后的關(guān)系,并對(duì)其生物學(xué)功能在肺癌細(xì)胞株中進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證。 研究方法及結(jié)果： 1.重組人TIP30基因克隆、蛋白表達(dá)、純化及多克隆抗體的制備：成功克隆人TIP30基因,用含GST標(biāo)簽的pGEX-4T-2載體,構(gòu)建重組pGEX-TIP30表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。用異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)蛋白表達(dá),并以Gluta

6、thione-Sepharose 4B純化GST-TIP30融合蛋白,免疫新西蘭白兔,制備高滴度高特異性抗TIP30多克隆抗體。 2.組織芯片技術(shù)結(jié)合免疫組化檢測(cè)TIP30在肺癌組織中的表達(dá)及其與臨床指標(biāo)的關(guān)系：利用Envision法檢測(cè)TIP30在206例肺癌及相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)情況,按照免疫組化評(píng)分,將TIP30在肺癌組織中的表達(dá)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。TIP30蛋白呈棕黃色顆粒分布于細(xì)胞漿,未見(jiàn)胞核著色。正常肺癌組織均有

7、著色,主要分布于支氣管上皮和肺泡上皮。在非小細(xì)胞肺癌中TIP30低表達(dá)組占36.5％(72/197)；在9例小細(xì)胞肺癌中,TIP30均為低表達(dá)。在鱗狀細(xì)胞癌,腺癌,腺鱗癌中的低表達(dá)率分別為36.7％(33/90),36.2％(34/94)和38.5％(5/13),組織類型間TIP30表達(dá)無(wú)顯著性差異。比較70例病人原發(fā)灶和相應(yīng)的淋巴轉(zhuǎn)移灶中TIP30表達(dá)變化,TIP30在轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)水平明顯下降。在肺鱗癌中,高分化及I-II期癌組織中T

8、IP30的表達(dá)高,低分化及Ⅲ-IV期肺癌組織中其表達(dá)降低。在鱗癌和腺癌中TIP30和p53表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。對(duì)其中2001-2002年74例患者隨訪,TIP30和病人預(yù)后呈正相關(guān)。 3.TIP30對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移潛能的調(diào)節(jié)作用：運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blotting蛋白印跡檢測(cè)五種肺癌細(xì)胞(A549,NCI-H460,SK-MES-1,LTEP-a-2,H1299)內(nèi)源性TIP30基因的表達(dá)情況,選取TIP3

9、0高表達(dá)細(xì)胞株A549和TIP30低表達(dá)細(xì)胞株H1299。利用慢病毒載體干擾A549內(nèi)源TIP30表達(dá)或?qū)IP30導(dǎo)入H1299腫瘤細(xì)胞,和對(duì)照組相比,下調(diào)內(nèi)源性TIP30表達(dá)后A549細(xì)胞的增殖能力,軟瓊脂克隆形成能力,對(duì)無(wú)血清刺激耐受能力及遷移和侵襲能力顯著增強(qiáng)；而轉(zhuǎn)染TIP30后,H1299細(xì)胞的增殖減慢,軟瓊脂克隆形成數(shù)目少,細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著下降。 結(jié)論： 1.成功制備高純度高特異性抗人TIP30多克隆抗

10、體,為進(jìn)一步研究TIP30功能奠定基礎(chǔ)； 2.約36％的非小細(xì)胞肺癌組織中TIP30表達(dá)水平下降,TIP30和p53表達(dá)呈負(fù)相關(guān),TIP30表達(dá)水平和鱗癌的臨床分期和分化相關(guān),表明。TIP30表達(dá)失調(diào)參與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生和發(fā)展； 3.TIP30的表達(dá)水平和患者的存活時(shí)間密切相關(guān),檢測(cè)TIP30表達(dá)可能成為一項(xiàng)重要的預(yù)后判斷指標(biāo)； 4.TIP30的表達(dá)強(qiáng)度從正常組織,原發(fā)性癌組織和轉(zhuǎn)移灶中依次下降,體外實(shí)驗(yàn)證明T