豬AMSCs成脂分化過(guò)程中KLF15和KLF2的表達(dá)模式及姜黃素的調(diào)控作用.pdf

1、本研究旨在探討豬AMSCs成脂分化過(guò)程中KLF15和KLF2的表達(dá)模式及姜黃素對(duì)其表達(dá)模式的調(diào)控作用。研究采用1月齡健康仔豬，用外科手術(shù)方法采集頸背部脂肪組織，膠原酶消化過(guò)濾后，通過(guò)原代和傳代培養(yǎng)分離純化了脂肪干細(xì)胞。用3代以上的脂肪干細(xì)胞進(jìn)行成脂誘導(dǎo)分化，用油紅O染色提取法進(jìn)行了成脂分化程度的定量分析，用PCR檢測(cè)法進(jìn)行了KLF15和KLF2表達(dá)的定性分析，用熒光定量PCR檢測(cè)法進(jìn)行了KLF15和KLF2表達(dá)的定量分析，用不同濃度姜黃

2、素處理，檢測(cè)了姜黃素對(duì)成脂分化率及KLF15和KLF2表達(dá)模式的影響。通過(guò)上述研究，獲得如下結(jié)果：
　　1.豬AMSCs的分離培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化
　　用分離獲得的 F3代 AMSCs進(jìn)行成脂誘導(dǎo)分化（誘導(dǎo)液：100nmol/l羅格列酮+0.05mmol/l3-異丁基-1-甲基黃嘌呤+100nmol/l胰島素+100nmol/l地塞米松），油紅O提取法檢測(cè)AMSCs成脂分化率。結(jié)果顯示，在誘導(dǎo)2d后，少量細(xì)胞開(kāi)始分化，分化細(xì)胞內(nèi)可

3、見(jiàn)串珠狀小脂滴。隨著延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間，脂滴變大，數(shù)量增多；誘導(dǎo)9d后可見(jiàn)大脂滴，周?chē)錆M小脂滴；誘導(dǎo)15d時(shí)，成脂分化率可達(dá)到60％左右，表明本研究采用的誘導(dǎo)方法可行。
　　2.豬AMSCs誘導(dǎo)分化過(guò)程中 KLF15和KLF2的表達(dá)模式
　　為檢測(cè)KLF15的表達(dá)模式，將AMSCs在誘導(dǎo)環(huán)境中分別誘導(dǎo)分化2d、4d、8d、10d、12d和16d；為檢測(cè)KLF2的表達(dá)模式，將AMSCs在誘導(dǎo)環(huán)境中分別誘導(dǎo)分化6h、12h、24h、

4、30h和42h。收集不同時(shí)間誘導(dǎo)分化的細(xì)胞，提取總RNA，用熒光定量PCR分別檢測(cè) KLF15和KLF2 mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示，KLF15表達(dá)以2d表達(dá)量為對(duì)照，其它各天表達(dá)分別為2d的1.03±0.007、1.66±0.005、2.15±0.006、2.47±0.006和2.75±0.004倍；KLF2表達(dá)以6h表達(dá)量為對(duì)照，其它各小時(shí)表達(dá)倍數(shù)量分別為0.84±0.007、0.72±0.08、0.70±0.002和0.65±0.0

5、06。這些結(jié)果表明KLF15隨誘導(dǎo)時(shí)間的增加，表達(dá)量逐步增加，說(shuō)明KLF15促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化，在脂肪分化過(guò)程中起著重要作用；KLF2的表達(dá)量在成脂誘導(dǎo)分化6h時(shí)已達(dá)到高峰，之后隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)逐步下降，表明 KLF2在誘導(dǎo)分化早期，為維持前脂肪細(xì)胞階段發(fā)揮重要作用。
　　3.姜黃素對(duì)豬AMSCs成脂分化的影響
　　取匯合度達(dá)90%的F3代細(xì)胞，分別加入含1、5、10、15、20和25μmol/l的姜黃素的成脂誘導(dǎo)液作用24

6、h，然后在誘導(dǎo)液中誘導(dǎo)分化3d，之后換成維持液維持2d；如此循環(huán)誘導(dǎo)至10d，油紅O染色觀察成脂分化率。結(jié)果顯示，1~25μmol/l姜黃素均能顯著抑制（P＜0.05）細(xì)胞的分化，其抑制率分別為7.98%、14.55%、26.92%、39.75%、62.44%、65.26%，25μmol/l姜黃素抑制率最高，表明姜黃素能夠有效抑制成脂分化。
　　4.姜黃素對(duì)豬AMSCs成脂分化過(guò)程中KLF15表達(dá)模式的影響
　　取F3代細(xì)胞

7、，用含25μmol/l姜黃素的成脂誘導(dǎo)液作用24h，然后置換成脂誘導(dǎo)液，分別誘導(dǎo)4d、8d、10d、12d和16d，提取總RNA，用Real-time PCR檢測(cè)姜黃素對(duì)KLF15 mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，25μmol/l姜黃素抑制KLF15 mRNA表達(dá)率分別達(dá)到47.3%、62.6%、60.2%、41.6%和33.1%，可以看出姜黃素抑制KLF15 mRNA的表達(dá)能力在誘導(dǎo)分化中期最高，表明姜黃素抑制KLF15 mRNA的表達(dá)