人骨髓間充質(zhì)干細胞定向分化過程中轉(zhuǎn)錄因子KLF2和KLF15的表達研究.pdf

1、研究背景及意義：成熟脂肪細胞、肌細胞及成骨細胞可以由共同的間充質(zhì)干細胞分化而來。這三個方向的分化進程相互聯(lián)系、相互制約，在體內(nèi)呈現(xiàn)出動態(tài)的平衡關系。研究發(fā)現(xiàn)有些轉(zhuǎn)錄因子處于不同方向分化調(diào)控網(wǎng)絡的交叉點，其表達水平或與體內(nèi)各組織分化平衡狀態(tài)的維持密切相關。KLF轉(zhuǎn)錄因子家族(Kr(u)ppel-like factor family)成員KLF2和KLF15在脂肪組織中均有表達，在成脂分化不同階段發(fā)揮重要作用。此外，KLF2還表達于肌肉、骨

2、髓等部位，KLF15還表達于骨骼肌及骨組織，但它們在骨骼肌發(fā)育、骨組織形成中是否發(fā)揮重要作用還未見報道。目前關于KLF家族成員與細胞分化的相關數(shù)據(jù)多來自于具有單向分化潛能的細胞系，不利于將不同方向分化機制聯(lián)系并統(tǒng)一起來，而利用多向分化潛能的間充質(zhì)干細胞可以同步建立不同方向的體外分化模型，對KLF2和KLF15在各分化過程中的表達進行分析，為進一步研究KLF2和KLF15在成肌、成骨分化過程中的作用機制以及這三種分化過程的聯(lián)系提供依據(jù)。<

3、br>　　 目的：研究轉(zhuǎn)錄因子KLF2和KLF15在入骨髓間充質(zhì)干細胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs)成脂、成肌、成骨分化過程中的表達水平及變化趨勢，并通過與成脂相關因子PPAR(γ)、GLUT4、成骨相關因子RUNX2及成肌相關因子MYOD的表達模式進行比較，探討這些因子之間可能存在的聯(lián)系。
　　 方法：采用密度梯度離心法分離人骨髓間充質(zhì)干細胞，將貼壁細胞傳代

4、培養(yǎng)，采用第四代細胞分別向成骨細胞、成肌細胞與脂肪細胞進行誘導，應用茜素紅、油紅O染色和免疫熒光細胞化學方法對誘導分化的細胞進行鑒定。通過熒光實時定量聚合酶鏈反應(realtimePCR)檢測在誘導分化不同時間點KLF2、KLF15、PPAR(γ)、GLUT4、myoD和RUNX2的mRNA表達水平，通過免疫熒光細胞化學方法檢測在誘導分化不同時間點KLF2和KLF15蛋白的定位和豐度。
　　 結(jié)果：在特定誘導劑作用下hBMSCs

5、可分化為脂肪細胞、成肌細胞與成骨細胞，經(jīng)鑒定均為陽性。
　　 熒光實時定量PCR結(jié)果顯示KLF2在hBMSCs成脂、成肌分化早期表達水平均呈下降趨勢，在成骨分化中也有下降趨勢，早期不明顯；KLF15在成脂分化中期及成肌、成骨分化早期mRNA表達水平均表現(xiàn)為上升趨勢。免疫熒光染色支持定量PCR結(jié)果。
　　 定向誘導hBMSCs成脂、成肌、成骨過程中分別檢測到相關標志基因的上調(diào)。
　　 結(jié)論：在hBMSCs成脂、成肌