誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞軟骨定向分化的關(guān)鍵因子篩選及體外誘導(dǎo)方案優(yōu)化.pdf

1、軟骨組織損傷后的自我修復(fù)能力極低,是臨床難治疾病之一。軟骨組織工程為軟骨組織缺損修復(fù)提供了新的途徑。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrowmesenchymal stem cells,BMSCs)因其取材方便,體外擴(kuò)增能力強(qiáng)及具有軟骨分化潛能,已逐漸成為軟骨組織工程的重要種子細(xì)胞來(lái)源之一。但是現(xiàn)有的誘導(dǎo)BMSCs向軟骨分化的方法存在誘導(dǎo)效率低,效果不穩(wěn)定,非生理性誘導(dǎo)等缺點(diǎn),尋找更加有效的誘導(dǎo)方法勢(shì)在必行。
　　 已有研究發(fā)現(xiàn)

2、關(guān)節(jié)微環(huán)境能夠促進(jìn)BMSCs軟骨分化。軟骨細(xì)胞是軟骨組織中的唯一細(xì)胞類(lèi)型,是關(guān)節(jié)微環(huán)境內(nèi)最主要成分。課題組在前期研究中通過(guò)軟骨細(xì)胞與BMSCs混合共培養(yǎng)證實(shí)了軟骨細(xì)胞能夠部分模擬關(guān)節(jié)內(nèi)的軟骨微環(huán)境誘導(dǎo)BMSCs軟骨分化,并進(jìn)一步建立了軟骨細(xì)胞.材料復(fù)合物和BMSCs-材料復(fù)合物的隔離共培養(yǎng)體系,證實(shí)軟骨細(xì)胞-材料復(fù)合物分泌的可溶性因子能夠單獨(dú)誘導(dǎo)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化。
　　 本課題中,我們?cè)O(shè)想從軟骨細(xì)胞分泌的可溶性因子中篩選

3、有誘導(dǎo)作用的關(guān)鍵因子,從而指導(dǎo)我們建立成分明確,效果穩(wěn)定的誘導(dǎo)方法。然而,可溶性因子成分種類(lèi)繁多,一一進(jìn)行分析是不現(xiàn)實(shí)的,我們需要一種大容量,多因素的分析方法。蛋白質(zhì)組學(xué)是對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行大規(guī)模研究的一門(mén)科學(xué),具有大規(guī)模,高通量等優(yōu)點(diǎn),可用于研究極其復(fù)雜的多種細(xì)胞因子和蛋白質(zhì)的變化。與之相互補(bǔ)的蛋白質(zhì)芯片技術(shù)是近年來(lái)蛋白質(zhì)組學(xué)研究中興起的一種新的方法,是一種高通量,靈敏度更高且具有高度準(zhǔn)確性的研究方法,能在一次實(shí)驗(yàn)中提供相當(dāng)大的信息量,使我

4、們能夠全面、準(zhǔn)確的研究蛋白表達(dá)譜,這是傳統(tǒng)的蛋白研究方法無(wú)法做到的?，F(xiàn)在這兩種技術(shù)已逐漸成為干細(xì)胞和組織工程領(lǐng)域的重要研究方法。因此,我們考慮通過(guò)差異蛋白質(zhì)組學(xué)和蛋白質(zhì)芯片技術(shù)從軟骨細(xì)胞分泌的可溶性因子中篩選有主要誘導(dǎo)作用的因子。
　　 通過(guò)差異蛋白質(zhì)組或蛋白芯片篩選有誘導(dǎo)作用的因子,我們要解決的第一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題是必須要找到合適的比較對(duì)象,兩者差異太大勢(shì)必增加分析時(shí)的難度和工作量；兩者差異太小,可能會(huì)遺漏一些重要因子。我們?cè)O(shè)想軟骨

5、細(xì)胞-材料復(fù)合物在形成組織工程化軟骨和成熟過(guò)程類(lèi)似于體內(nèi)軟骨形成過(guò)程,在這一過(guò)程中所分泌因子在不同時(shí)期的組成成分和含量是不一樣的:軟骨細(xì)胞-材料復(fù)合物在組織形成過(guò)程中分泌的因子是軟骨形成過(guò)程中所需的,更能有效誘導(dǎo)BMSCs軟骨分化；而后期的軟骨細(xì)胞-材料復(fù)合物已基本形成了軟骨組織,分泌的因子種類(lèi)和劑量可能以維持軟骨形態(tài)為主,而非誘導(dǎo)分化為主的因子。因此,我們?cè)O(shè)想首先對(duì)不同時(shí)期的軟骨細(xì)胞-材料復(fù)合物的誘導(dǎo)作用進(jìn)行系統(tǒng)的比較,從而為差異蛋白

6、質(zhì)組和蛋白質(zhì)芯片實(shí)驗(yàn)確定合適的比較樣本,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
　　 進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組或蛋白芯片實(shí)驗(yàn)的另一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題是無(wú)血清培養(yǎng)基的建立。血清中的高豐度蛋白會(huì)影響蛋白實(shí)驗(yàn)結(jié)果,但是,直接去除血清會(huì)影響軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)過(guò)程中的存活、增殖、軟骨表型的維持,以及軟骨組織的構(gòu)建。因此,我們實(shí)驗(yàn)中需要建立一種良好的無(wú)血清培養(yǎng)基,既能維持軟骨細(xì)胞的正常表型和軟骨組織形成,又不會(huì)干擾蛋白質(zhì)組和蛋白芯片的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。我們根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和初步的實(shí)驗(yàn)篩選

7、,選取了能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞存活和增殖,有利于軟骨細(xì)胞表型保持和細(xì)胞外基質(zhì)分泌的因子和非蛋白物質(zhì),如胰島素鐵硒傳遞蛋白,地塞米松和維生素C。然后,研究了它們作為無(wú)血清培養(yǎng)基主要成分對(duì)軟骨細(xì)胞表型維持和軟骨組織構(gòu)建的影響,并最終建立了符合實(shí)驗(yàn)需要的無(wú)血清培養(yǎng)基。
　　 通過(guò)上述兩個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題的解決,為我們后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。我們應(yīng)用高通量的差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和蛋白質(zhì)芯片技術(shù),對(duì)具有不同誘導(dǎo)能力的軟骨細(xì)胞-材料復(fù)合物分泌的可溶性因子作比較

8、,找到差異蛋白,初步篩選了可能具有軟骨誘導(dǎo)作用的關(guān)鍵因子,期望能有利于建立成分明確,效果穩(wěn)定的誘導(dǎo)方法,為軟骨組織工程向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化提供理論和技術(shù)支持。
　　 研究目的:將組織工程技術(shù)與蛋白質(zhì)芯片和差異蛋白質(zhì)組學(xué)相結(jié)合,從軟骨細(xì)胞分泌的可溶性因子中篩選關(guān)鍵的軟骨誘導(dǎo)因子,以期幫助建立成分明確,效果穩(wěn)定的誘導(dǎo)方法,為以BMSCs為種子細(xì)胞的軟骨組織工程應(yīng)用于臨床奠定理論基礎(chǔ),提供技術(shù)支持。
　　 方法和結(jié)果:
　　

9、 1不同時(shí)期軟骨細(xì)胞-材料復(fù)合物誘導(dǎo)作用的比較
　　 方法建立隔離共培養(yǎng)體系,通過(guò)軟骨細(xì)胞-材料復(fù)合物與BMSCs-材料復(fù)合物的隔離共培養(yǎng),觀察和比較軟骨細(xì)胞接種支架材料3天后(3d組),2周后(2w組)和8周后(8w組)開(kāi)始的隔離共培養(yǎng)中軟骨細(xì)胞-材料復(fù)合物分泌的可溶性因子對(duì)BMSCs成軟骨誘導(dǎo)作用的差異。
　　 結(jié)果3d組BMSCs-材料復(fù)合物形成了較均勻的軟骨樣組織,組織學(xué)呈現(xiàn)典型的軟骨陷窩結(jié)構(gòu)；2w組僅在周邊部形

10、成了典型的軟骨樣結(jié)構(gòu),內(nèi)部則為纖維狀成分；晚期8周組則收縮變形,僅形成了纖維樣結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)論軟骨細(xì)胞分泌的可溶性因子能夠誘導(dǎo)BMSCs成軟骨分化,而且早期軟骨細(xì)胞-材料復(fù)合物的分泌液對(duì)BMSCs的成軟骨誘導(dǎo)作用明顯強(qiáng)于晚期分泌液的誘導(dǎo)作用。
　　 2無(wú)血清培養(yǎng)基的建立
　　 方法培養(yǎng)豬耳軟骨細(xì)胞,分為無(wú)血清組和含血清組,無(wú)血清組應(yīng)用包含胰島素鐵硒傳遞蛋白(ITS)、地塞米松及維生素C為主要成分的無(wú)血清培養(yǎng)基,

11、含血清組應(yīng)用包含10％血清的常規(guī)培養(yǎng)基,觀察了平面和三維培養(yǎng)狀態(tài)下無(wú)血清培養(yǎng)基對(duì)軟骨細(xì)胞增殖,基質(zhì)分泌和軟骨形成的作用。
　　 結(jié)果平面培養(yǎng)條件下,無(wú)血清培養(yǎng)組的細(xì)胞增殖率出現(xiàn)輕度下調(diào),但在三維培養(yǎng)情況下可以保持軟骨細(xì)胞存活和軟骨細(xì)胞的表型,在二型膠原和蛋白多糖染色方面與含血清組相當(dāng),軟骨特異基因ColⅡ,Aggrecan的表達(dá)與含血清組無(wú)明顯差異,并能夠形成較好的軟骨樣組織。
　　 結(jié)論以ITS,地塞米松及維生素C為主

12、要成分建立的無(wú)血清培養(yǎng)基在三維培養(yǎng)條件下能基本保持軟骨細(xì)胞的存活和表型,能用于軟骨細(xì)胞的體外三維培養(yǎng)。
　　 3軟骨細(xì)胞-材料復(fù)合物分泌的可溶性因子中具有軟骨誘導(dǎo)作用因子的初步篩選
　　 方法培養(yǎng)人肋軟骨來(lái)源軟骨細(xì)胞,藻酸鹽凝膠包埋,接種PGA/PLA材料后,體外培養(yǎng)3天后開(kāi)始交替無(wú)血清和含血清培養(yǎng),交替時(shí)間為3天,取無(wú)血清培養(yǎng)的上清作樣本,將培養(yǎng)2周內(nèi)的上清樣本作為早期組,將培養(yǎng)8周-10周的上清樣本作為晚期組,兩組樣

13、本經(jīng)過(guò)差異蛋白質(zhì)組和蛋白質(zhì)芯片初步篩選差異蛋白,并從基因水平和蛋白水平證實(shí)其表達(dá)差異。初步將所篩選蛋白IGFBP-4,6用于誘導(dǎo)成分,觀察其對(duì)BMSCs成軟骨的誘導(dǎo)作用。
　　 結(jié)果:差異蛋白組學(xué)發(fā)現(xiàn)早期和晚期有52個(gè)差異點(diǎn)(差異大于2倍),選取其中30個(gè)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析,鑒定出蛋白13個(gè),其中具有軟骨誘導(dǎo)作用的蛋白因子還在進(jìn)一步篩選證實(shí)中。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞早期分泌較晚期有6個(gè)因子高表達(dá)(差異大于2倍),包括胰島素樣生長(zhǎng)

14、因子結(jié)合蛋白2,4和6(IGFBP-2,4,6)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2,6(FGF-2,6),將IGFBP-4,6作為候選因子,通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)和PCR檢測(cè)從蛋白水平和基因水平證實(shí)這兩個(gè)因子在早期和晚期的軟骨細(xì)胞-材料復(fù)合物分泌液和組織中的表達(dá)差異。
　　 結(jié)論:蛋白質(zhì)芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)IGFBP-4,6等6個(gè)生長(zhǎng)因子類(lèi)蛋白在早期高表達(dá),差異蛋白組學(xué)發(fā)現(xiàn)52個(gè)差異點(diǎn),具有軟骨誘導(dǎo)作用的蛋白因子需要進(jìn)一步篩選。
　　 4 IG

15、FBP-4,6誘導(dǎo)BMSCs成軟骨分化的作用研究
　　 方法:將IGFBP-4,6作為誘導(dǎo)成分單獨(dú)(IGFBP4,6單獨(dú)誘導(dǎo)組)應(yīng)用或添加于BMSCs常規(guī)成軟骨誘導(dǎo)液中(聯(lián)合誘導(dǎo)組),觀察IGFBP-4,6誘導(dǎo)BMSCs成軟骨情況,對(duì)照組1應(yīng)用含有轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGFβ-1)的常規(guī)成軟骨誘導(dǎo)液,對(duì)照組2應(yīng)用未添加TGFβ-1的基本軟骨誘導(dǎo)液。在20天分別取材行大體觀察,HE,甲苯胺藍(lán)染色和二型膠原免疫組化染色,半定量PCR方

16、法檢測(cè)成軟骨相關(guān)基因的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果:誘導(dǎo)第20天可在對(duì)照組1和聯(lián)合誘導(dǎo)組的pellets周邊部看到軟骨陷窩的形成,甲苯胺藍(lán)染色和二型膠原免疫組化染色更陽(yáng)性,主要分布在pellets的外周。對(duì)照組2和IGFBP4,6單獨(dú)誘導(dǎo)組未見(jiàn)軟骨樣組織形成。PCR結(jié)果顯示,軟骨特異基因二型膠原(ColⅡ)和核心蛋白(Aggrecan)在四組均有陽(yáng)性表達(dá),其中聯(lián)合誘導(dǎo)組和對(duì)照組1的表達(dá)明顯的強(qiáng)于另外兩組,Aggrecan的表達(dá)在聯(lián)合誘

17、導(dǎo)組強(qiáng)于對(duì)照組1；Sox9僅在陽(yáng)性對(duì)聯(lián)合誘導(dǎo)組和對(duì)照組1表達(dá),聯(lián)合誘導(dǎo)組明顯強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照組。
　　 結(jié)論:100ng/ml IGFBP-4和100ng/m6尚不能單獨(dú)誘導(dǎo)BMSCs成軟骨分化,但是可能與TGFβ-1協(xié)同作用促進(jìn)TGFβ-1的成軟骨誘導(dǎo)作用。
　　 綜上所述,本研究將組織工程技術(shù)與差異蛋白質(zhì)組學(xué)相結(jié)合,從一個(gè)全新的,系統(tǒng)的角度來(lái)研究軟骨細(xì)胞分泌的可溶性因子,篩選其中有主要誘導(dǎo)作用的因子,為建立良好的誘導(dǎo)方法