MicroRNA-10a可通過(guò)調(diào)控KLF4再生人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化功能.pdf

1、背景及目的：
　　人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human mesenchymal stem cells，hMSC）是一種具有多種潛能的細(xì)胞，具有自我更新和多向分化的能力，例如：細(xì)胞可以復(fù)制增殖，細(xì)胞可以分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞等等。hMSC在細(xì)胞組織再生和穩(wěn)態(tài)維持中的作用得到了廣泛的關(guān)注。人類年齡的增加，是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，伴隨著年齡相關(guān)疾病的增加。有很多研究證實(shí)了年齡因素影響了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的功能，例如：集落形成

2、單位（CFU）的數(shù)量較少；細(xì)胞增殖能力下降；細(xì)胞分化能力下降，包括成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞分化等；隨年齡增加端粒的長(zhǎng)度縮短等等。細(xì)胞來(lái)源宿主的年齡是影響臨床前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵因素。
　　微小RNA(MicroRNAs，miRNAs)是長(zhǎng)度為20個(gè)核苷酸左右的單鏈內(nèi)源性非編碼小RNA，裝配入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)中對(duì)多種生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程起調(diào)控作用。miRN

3、As可與其靶基因的3’UTR互補(bǔ)結(jié)合直接降解其靶基因或者抑制其編碼的蛋白質(zhì)的翻譯。miRNAs在多種細(xì)胞過(guò)程中起調(diào)控作用，例如：細(xì)胞存活、復(fù)制性衰老、增殖、分化等等。miRNAs的表達(dá)隨年齡增加而發(fā)生改變，而且miRNAs自身也可能參與調(diào)控了年齡增加的過(guò)程。最近的研究發(fā)現(xiàn)miRNAs在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化過(guò)程中表達(dá)發(fā)生改變，miRNAs對(duì)干細(xì)胞分化可能起調(diào)控作用。miR-196a可通過(guò)調(diào)控HOXC8基因促進(jìn)脂肪細(xì)胞來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨

4、細(xì)胞分化，而miR-21可通過(guò)調(diào)控TGFBR2基因促進(jìn)其脂肪細(xì)胞分化。miR-204/211通過(guò)抑制RUNX2的表達(dá)，可以促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化而抑制其向成骨細(xì)胞分化。有研究發(fā)現(xiàn)，在hMSC成軟骨細(xì)胞分化過(guò)程中，miRNA-140伴隨Sox9和Col2a1基因表達(dá)而升高。MiR-148b，miR-27a和miR-489被證實(shí)可以調(diào)控hMSC成骨細(xì)胞的早期分化。雖然現(xiàn)在的研究取得了不少成果，但年齡相關(guān)的miRNAs在hMSC分化過(guò)

5、程中的調(diào)控作用尚不清楚。本課題比較了不同年齡段來(lái)源的hMSC中miRNAs的表達(dá)差異，并研究了這些miRNAs在hMSC分化中的調(diào)控作用。
　　方法：
　　志愿者h(yuǎn)MSC于心外科手術(shù)過(guò)程中抽取，17至30歲志愿者h(yuǎn)MSC定義為年青組（young，Y），65至80歲志愿者h(yuǎn)MSC定義為年老組（old，O）。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)年青和年老hMSC中干細(xì)胞特異性抗原CD29，CD31，CD34，CD44，CD45和CD166的表達(dá)。

6、通過(guò)CellTiter96細(xì)胞增殖試劑盒檢測(cè)hMSC的增殖，通過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線比較年青和年老hMSC增殖能力。通過(guò)不同的誘導(dǎo)分化液，誘導(dǎo)hMSC向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞分化。通過(guò)免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞的表達(dá)，熒光定量PCR檢測(cè)和比較年青和年老hMSC成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)。通過(guò)β半乳糖苷酶染色比較年青和年老hMSC衰老程度。通過(guò)Affymetrix GeneChip2.0 miR

7、NA芯片比較年青和年老hMSC中miRNAs的表達(dá)差異。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)miR-10a的靶基因。通過(guò)慢病毒載體分別過(guò)表達(dá)miR-10a，抑制miR-10a表達(dá)和抑制KLF4表達(dá)，研究miR-10a和KLF4在hMSC增殖、分化和細(xì)胞衰老中的作用。
　　結(jié)果：
　　與年青hMSC相比，年老hMSC增殖能力和分化能力下降；年老hMSC細(xì)胞衰老程度增加，但間充質(zhì)干細(xì)胞特異性抗原未隨年齡增加而改變；與年青hMSC相比，

8、年老hMSC中高表達(dá)hsa-miR-196a，hsa-miR-378，hsa-miR-378-star，hsa-miR-486-5p和hsa-miR-664-star，相反hsa-miR-10a，hsa-miR-708和hsa-miR-3197在年老HMSC中低表達(dá)；KLF4為miR-10a的靶基因，miR-10a可直接抑制KLF4基因和蛋白的表達(dá)；過(guò)表達(dá)miR-10a可再生年青和年老hMSC分化能力（包括脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞及成軟骨細(xì)胞

9、分化），可減少細(xì)胞衰老，可抑制年青和年老 hMSC增殖能力；抑制miR-10a表達(dá)可獲得相反的結(jié)果：促進(jìn)年青和年老hMSC增殖，促進(jìn)細(xì)胞衰老，抑制hMSC分化；抑制KLF4表達(dá)可再生年青和年老hMSC分化能力（包括脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞及成軟骨細(xì)胞分化），可減少細(xì)胞衰老，抑制細(xì)胞增殖。
　　結(jié)論：
　　1.隨著年齡的增加，hMSC表面特異性抗原表達(dá)無(wú)差異; hMSC增殖能力，分化能力（包括脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞及成軟骨細(xì)胞分化）明顯

10、下降;hMSC細(xì)胞衰老程度增加;hMSC中microRNAs表達(dá)有差異。
　　2. miR-10a可再生年青和年老hMSC分化能力（包括脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞及成軟骨細(xì)胞分化）；可減少細(xì)胞衰老；可抑制年青和年老hMSC增殖能力。抑制miR-10a表達(dá)可促進(jìn)年青和年老hMSC增殖；促進(jìn)細(xì)胞衰老；抑制hMSC分化能力（包括脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞及成軟骨細(xì)胞分化）。
　　3. miR-10a可直接抑制KLF4基因和蛋白的表達(dá)。