KLF2調(diào)控S1PR1對類中性粒細(xì)胞遷移的影響.pdf

1、目的和意義：支氣管哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，約50％的哮喘與嗜酸性粒細(xì)胞炎癥有關(guān)，而其余的哮喘中大部分伴隨著中性粒細(xì)胞增多。在重癥哮喘患者的誘導(dǎo)痰中，中性粒細(xì)胞比例明顯增加。哮喘中性粒細(xì)胞增多與中性粒細(xì)胞凋亡延遲或減少有關(guān)，也與中性粒細(xì)胞表面粘附遷移分子表達(dá)增加，引起遷移增加有關(guān)。本文從細(xì)胞水平研究KLF2是否調(diào)控S1PR1，影響類中性粒細(xì)胞遷移。
　　方法：
　?。?）將HL-60細(xì)胞用含1.3%DMSO培養(yǎng)5天后，分

2、化為類中性粒細(xì)胞，通過迪夫快速染色法觀察細(xì)胞核形態(tài)及Realtime PCR檢測中性粒細(xì)胞分化標(biāo)志物CD11b mRNA的表達(dá)，確定是否誘導(dǎo)成功。
　　（2）用空載及KLF2-RNAi慢病毒載體感染類中性粒細(xì)胞。應(yīng)用熒光顯微鏡鑒定感染率。應(yīng)用Western blot、Realtime PCR進(jìn)行KLF2敲減率鑒定。
　?。?）Realtime PCR檢測三組(空白組、空載組、干擾組)中KLF2、S1PR1mRNA的表達(dá)，We

3、stern blot檢測三組中KLF2、S1PR1蛋白的表達(dá)，免疫熒光檢測KLF2蛋白表達(dá)。
　?。?）應(yīng)用Transwell實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)0.1μM S1P對三組類中性粒細(xì)胞的趨化遷移率。
　　結(jié)果：
　　1.成功的將HL-60細(xì)胞誘導(dǎo)成類中性粒細(xì)胞
　　將HL-60細(xì)胞用含1.3%DMSO培養(yǎng)5天后提取細(xì)胞，經(jīng)迪夫快速染色法發(fā)現(xiàn)細(xì)胞體積變小，出現(xiàn)腎型核。Real-timePCR檢測CD11b mRNA表達(dá)情況，類中

4、性粒細(xì)胞CD11b表達(dá)明顯增加（P＜0.01）。
　　2.慢病毒轉(zhuǎn)染
　?、贌晒怙@微鏡下觀察干擾組和空載組的感染效率，感染效率達(dá)到90%以上。
　?、贙LF2表達(dá)情況
　　Real-timePCR結(jié)果中，干擾組較空白組、空載組KLF2表達(dá)明顯減少（P＜0.01），空載組和空白組KLF2表達(dá)基本相同（P＞0.05），計(jì)算其敲除率約為81%。慢病毒成功干擾KLF2基因表達(dá)，且排除病毒本身的干擾。免疫熒光顯示，干擾組較

5、空白組、空載組KLF2表達(dá)減少。
　　3.S1PR1 mRNA表達(dá)變化
　　Realtime PCR結(jié)果中，干擾組較空白組、空載組S1PR1表達(dá)明顯減少（P＜0.01），4.S1PR1蛋白表達(dá)變化
　　Western blot結(jié)果中，干擾組較空白組、空載組S1PR1表達(dá)明顯減少（P＜0.01）。5.Transwell實(shí)驗(yàn)：
　　選取0.1μM濃度的S1P進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn)，干擾組較空白組、空載組，遷移率明