KLF2與S1PR1對(duì)哮喘患者外周血中性粒細(xì)胞遷移的影響.pdf

1、目的：通過(guò)觀察健康志愿者與不同程度哮喘患者外周血中性粒細(xì)胞（neutrophil，NEU）百分比，分離中性粒細(xì)胞檢測(cè)中性粒細(xì)胞KLF2、S1PR1的表達(dá)及中性粒細(xì)胞的遷移率，探討KLF2與S1PR1對(duì)哮喘患者外周血中性粒細(xì)胞遷移的影響，從而為哮喘的防治提供新思路。
　　方法：隨機(jī)收取2014年04月-2016年03月于湖南省馬王堆醫(yī)院及長(zhǎng)沙市第三醫(yī)院住院的急性發(fā)作期哮喘患者29例，按照病情程度分為輕度哮喘組（L組）、中度哮喘組（M

2、組）、重度哮喘組（S組），選取年齡、性別與哮喘患者相匹配的健康自愿者作為健康對(duì)照組（C組）。于入院6小時(shí)內(nèi)采取外周血分離中性粒細(xì)胞，隨后進(jìn)行染色鑒定，免疫熒光明確KLF2在中性粒細(xì)胞上的定位，采用Realtime-PCR檢測(cè)各組研究對(duì)象中性粒細(xì)胞KLF2與S1PR1mRNA的表達(dá)，Western-blot檢測(cè)各組研究對(duì)象中性粒細(xì)胞KLF2與S1PR1蛋白的表達(dá)，利用Transwell小室測(cè)定中性粒細(xì)胞的遷移率。
　　結(jié)果：

3、　　1.各組研究對(duì)象外周血白細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)
　　健康對(duì)照組、輕、中、重度哮喘組外周血中性粒細(xì)胞百分比呈升高趨勢(shì)，分別為（61.35(51.90～65.70)、62.54(54.75～66.12)、70.20(65.34～75.50)、89.84(73.35～94.57)），且健康對(duì)照組、輕度哮喘組與重度哮喘組比較，健康對(duì)照組、輕度哮喘組與中度哮喘組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　2.中性粒細(xì)胞的分離及鑒定

4、>　　采用梯度離心法及時(shí)分離外周血中性粒細(xì)胞，然后用PBS重懸，進(jìn)行迪夫染色，油鏡下觀察中性粒細(xì)胞核呈腎型、桿狀及分葉核，純度達(dá)到95％以上。臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定存活率大于90%。
　　3.外周血中性粒細(xì)胞KLF2的定位
　　免疫熒光結(jié)果示：KLF2在人外周血中性粒細(xì)胞中表達(dá)，主要定位于中性粒細(xì)胞胞核，胞漿亦有少量表達(dá)。
　　4.各組研究對(duì)象外周血中性粒細(xì)胞KLF2與S1PR1 mRNA的表達(dá)
　　對(duì)于健康對(duì)照組、輕、

5、中、重度哮喘組，KLF2 mRNA的表達(dá)（1.00（0.96～1.05）、0.80（0.77～0.85）、0.49（0.45～0.52）、0.33（0.32～0.35））依次呈下降趨勢(shì)，而S1PR1 mRNA的表達(dá)（0.99（0.76～1.21）、2.45（2.11～2.81）、3.68（3.41～5.50）、7.52（6.89～7.98））依次呈上升趨勢(shì)。這兩個(gè)因子，中、重度哮喘組與健康對(duì)照組比較，重度哮喘組與輕度哮喘組比較，差異均有

6、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　5.各組研究對(duì)象外周血中性粒細(xì)胞KLF2與S1PR1蛋白的表達(dá)
　　Western-blot分析結(jié)果示：對(duì)于健康對(duì)照組、輕、中、重度哮喘組,KLF2蛋白的表達(dá)（0.515（0.390～0.605），0.450（0.385～0.545），0.370（0.310～0.430），0.260（0.245～0.300））依次呈下降趨勢(shì)，而S1PR1蛋白的表達(dá)（0.250（0.233～0.345），0.

7、350（0.290～0.435），0.400（0.360～0.410），0.540（0.490～0.615））依次呈上升趨勢(shì)，且以上兩個(gè)因子，中、重度哮喘組與健康對(duì)照組比較，重度哮喘組與輕度哮喘組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　6.各組研究對(duì)象外周血中性粒細(xì)胞遷移率的測(cè)定
　　根據(jù)我室前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取0.1uM的S1P進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn)，遷移率結(jié)果顯示：健康對(duì)照組、輕、中、重度哮喘組中性粒細(xì)胞遷移率

8、依次（4.28（3.04～5.06），10.35（9.40～11.18），16.05（14.70～18.15），20.70（19.05～22.80））呈增加趨勢(shì)。輕、中、重度哮喘組與健康對(duì)照組比較，重度哮喘組與輕度哮喘組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　7.研究對(duì)象外周血中性粒細(xì)胞KLF2mRNA及蛋白與S1PR1 mRNA及蛋白表達(dá)的相關(guān)分析
　　所有研究對(duì)象外周血中性粒細(xì)胞KLF2與S1PR1 mRNA表達(dá)做

9、
　　Pearson相關(guān)分析（r=-0.891，P<0.01）,而 KLF2與S1PR1蛋白的Pearson相關(guān)分析顯示（r=-0.671，P<0.01），提示無(wú)論在mRNA或蛋白表達(dá)水平KLF2與S1PR1的表達(dá)量均呈負(fù)相關(guān)。
　　8.研究對(duì)象中性粒細(xì)胞KLF2、S1PR1蛋白表達(dá)與中性粒細(xì)胞遷移率的相關(guān)分析
　　KLF2蛋白表達(dá)與中性粒細(xì)胞遷移率做 Pearson相關(guān)分析，結(jié)果示（r=-0.664，P<0.01），

10、提示兩者呈負(fù)相關(guān)。S1PR1蛋白表達(dá)與中性粒細(xì)胞遷移率做Pearson相關(guān)分析，結(jié)果顯示(r=0.810，P<0.01），提示兩者呈正相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1.哮喘患者中性粒細(xì)胞 KLF2的表達(dá)隨著哮喘嚴(yán)重程度的加重而下降，趨化因子受體S1PR1的表達(dá)隨著哮喘嚴(yán)重程度的加重而上升，中性粒細(xì)胞的遷移率隨之而升高。
　　2.哮喘患者外周血中性粒細(xì)胞 KLF2表達(dá)下調(diào)可能通過(guò)負(fù)調(diào)控趨化因子受體S1PR1的表達(dá)，促進(jìn)中性粒細(xì)