KLF2調(diào)控Nrf2-Bach1在CSE誘導(dǎo)的大鼠氣道上皮細(xì)胞氧化與抗氧化機制中的作用.pdf

1、目的：研究Klf2及Nrf2/Bach1在經(jīng)CSE刺激的大鼠氣道上皮細(xì)胞中的表達(dá)，明確其感受氧化應(yīng)激對靶基因γ-GCS的調(diào)控作用；探討CSE對氣道上皮細(xì)胞凋亡的影響，及其與氧化抗氧化反應(yīng)之間的關(guān)系；觀察 KLF2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后分別對Nrf2、Bach1和γ-GCS表達(dá)水平的影響。
　　方法：實驗分為兩部分。⑴不轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞部分：采用酶消化法提取大鼠原代氣管-支氣管上皮細(xì)胞，噻唑藍(lán)（MTT）比色法測定10％香煙煙霧提取物（ciga

2、rette smoke extract，CSE）在不同時間點作用于細(xì)胞后對細(xì)胞增殖的影響；選取6小時時間點用Hoechst染色觀察細(xì)胞形態(tài)變化；并檢測該時間點細(xì)胞活性氧ROS含量；用雙酶法檢測γ-GCS活性；通過免疫細(xì)胞化學(xué)法觀察Nrf2/Bach1的核轉(zhuǎn)位；Western blot、RT-PCR技術(shù)研究細(xì)胞中Klf2、Nrf2、Bach1、γ-GCS的蛋白及mRNA表達(dá)。⑵轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞部分：給予Klf2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞使之基因過表達(dá)，用

3、Western blot、RT-PCR法觀察細(xì)胞中Klf2、Nrf2、Bach1、γ-GCS的蛋白及mRNA表達(dá)變化。
　　結(jié)果：①CSE對細(xì)胞增殖的抑制呈時間依賴性（P＜0.05）；Hoechst染色和電鏡觀察結(jié)果為核染色質(zhì)的濃縮和邊集,甚至于核碎裂；②CSE組細(xì)胞中ROS含量、γ-GCS活性均較正常組細(xì)胞顯著升高（P＜0.01）；③免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示Nrf2經(jīng)CSE刺激后出現(xiàn)由核外向核內(nèi)的轉(zhuǎn)位，相反的Bach1經(jīng)CSE刺激后

4、出現(xiàn)由核內(nèi)向核外的轉(zhuǎn)位（P<0.05）；④Western blot結(jié)果顯示CSE處理組中Klf2、Nrf2、Bach1、γ-GCS蛋白水平較對照組升高（P<0.05）；⑤RT-PCR顯示CSE組中Klf2、Nrf2、Bach1、γ-GCS mRNA水平較對照組升高（P<0.05）；⑥Klf2過表達(dá)質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，大鼠氣道上皮細(xì)胞中 Nrf2及γ-GCSmRNA、蛋白質(zhì)表達(dá)水平均顯著高于轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組（P<0.01）；而Bach1mR

5、NA表達(dá)水平明顯低于空白質(zhì)粒組（P<0.05），其蛋白表達(dá)與空白質(zhì)粒組無明顯差別（P>0.05）；⑦經(jīng)10%CSE處理6h的空白質(zhì)粒組中Nrf2、γ-GCSmRNA與蛋白質(zhì)水平均明顯高于未經(jīng)處理的空白質(zhì)粒組（P<0.05）；Bach1mRNA水平明顯低于未經(jīng)處理的空白質(zhì)粒組（P<0.05），其蛋白水平與對照組無明顯差別（P>0.05）；⑧經(jīng)10%CSE處理6h的Klf2質(zhì)粒組中Nrf2、γ-GCSmRNA與蛋白質(zhì)水平均明顯高于未經(jīng)處理的

6、Klf2質(zhì)粒組（P<0.05）；Bach1mRNA與蛋白質(zhì)水平明顯低于未經(jīng)處理的Klf2質(zhì)粒組（P<0.05）；⑨經(jīng)10%CSE處理6h的Klf2質(zhì)粒組中Nrf2、γ-GCSmRNA與蛋白質(zhì)水平均明顯高于經(jīng)10%CSE處理6h的空白質(zhì)粒組（P<0.05）；Bach1mRNA與蛋白質(zhì)水平明顯低于經(jīng)10%CSE處理6h的空白質(zhì)粒組（P<0.05）。
　　結(jié)論：⑴CSE誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，使胞內(nèi)ROS含量上升，最終效應(yīng)是誘導(dǎo)細(xì)胞的