KLF2調(diào)控Nrf2-Bach1在屋塵螨抗原處理的支氣管上皮細(xì)胞中對(duì)抗氧化應(yīng)激的作用.pdf

1、目的：哮喘的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，氣道的“自由基損傷”和“氧化/抗氧化失衡”學(xué)說(shuō)已引起廣泛重視。作為抵御外界刺激的首要防線，氣道上皮細(xì)胞暴露于過(guò)敏原時(shí)，可以通過(guò)分泌多種趨化因子，吸引炎性細(xì)胞聚集于肺部并產(chǎn)生大量活性氧化物質(zhì)（Reactive oxygen species,ROS)進(jìn)而對(duì)肺組織造成氧化損傷。而屋塵螨（Dermatophagoides pteronyssinus1,Derp1)抗原是一種普遍常見(jiàn)的室內(nèi)過(guò)敏原，在哮喘的發(fā)病機(jī)制

2、中起著重要的作用。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)屋塵螨抗原，是否直接對(duì)大鼠支氣管上皮細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷，同時(shí)檢測(cè)大鼠氣道上皮細(xì)胞中肺Krüppe樣轉(zhuǎn)錄因子（Krüppel-like factor2,KLF2)、紅系衍生核因子相關(guān)因子-2（NF-E2 related factor2,Nrf2）、BTB-CNC異體同源體1（BTB and CNChomology1,Bach1)和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamylcysteine synthetase

3、,γ-GCS）的表達(dá)變化；此外，過(guò)表達(dá)KLF2基因，探討KLF2與Nrf2、Bach1之間的調(diào)控機(jī)制，以及對(duì)γ-GCS基因的影響，在細(xì)胞水平探索抗氧化基因在在氧化應(yīng)激及支氣管哮喘發(fā)病中的可能作用，為未來(lái)哮喘的預(yù)防和治療提供新的理論依據(jù)。
　　方法：⑴選取體重約120~140g的雄性SD大鼠，以戊巴比妥鈉處死大鼠。采用0.5％鏈酶蛋白酶對(duì)大鼠氣道上皮側(cè)進(jìn)行4℃冷消化過(guò)夜，聯(lián)用細(xì)胞刷機(jī)械刷洗獲取大鼠氣管、支氣管上皮細(xì)胞，并置于無(wú)血清完

4、全K-SFM培養(yǎng)基中進(jìn)行原代培養(yǎng)。通過(guò)免疫熒光化學(xué)、電子顯微鏡等鑒定細(xì)胞，測(cè)定細(xì)胞成活率及細(xì)胞膜完整性。⑵予以大鼠支氣管上皮細(xì)胞不同的干預(yù)及處理方式，隨機(jī)將細(xì)胞分為:單純培養(yǎng)組即對(duì)照組(A組)，Derp1抗原(5μg/ml)組即塵螨組(B組)，Derpl抗原((5μg/ml))+地塞米松(Dexamethasone，DEX)組即地塞米松組(C組)，分別培養(yǎng)8h，采用雙酶法檢測(cè)各組細(xì)胞γ-GCS活性；采用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）

5、檢測(cè)各組細(xì)胞KLF2、Nrf2、Bach1、γ-GCS mRNA的表達(dá)；采用免疫印跡（Western blot）檢測(cè)各組細(xì)胞KLF2、Nrf2、Bach1及γ-GCS蛋白水平。⑶采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá) KLF2基因，將大鼠支氣管上皮細(xì)胞隨機(jī)分為空白質(zhì)粒組（A組）、KLF2重組質(zhì)粒組（B組），用免疫熒光法觀察A組和B組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效果，用RT-PCR和Western blot檢測(cè)各組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率。再將以上兩組細(xì)胞以對(duì)照組（1組）、塵螨組（2組）

6、和地塞米松組（3組）以不同干預(yù)方式處理，采用RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中Nrf2、Bach1、γ-GCS mRNA表達(dá)；用Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中Nrf2、Bach1及γ-GCS蛋白變化。
　　結(jié)果：①采用低濃度鏈酶消化聯(lián)合刷洗法取得的氣管、支氣管上皮細(xì)胞有較高的純度和成活率，細(xì)胞于無(wú)血清K-SFM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好。免疫熒光顯示細(xì)胞角蛋白（cytokeratin CK19）染色陽(yáng)性，抗體主要表達(dá)于胞漿，符合支氣管上皮細(xì)

7、胞特性；電鏡結(jié)果可見(jiàn)典型氣管-支氣管上皮細(xì)胞，細(xì)胞膜完整，胞漿內(nèi)細(xì)胞器完好，細(xì)胞一側(cè)有大量纖毛。②大鼠支氣管上皮細(xì)胞中γ-GCS活性在塵螨組（B）組高于對(duì)照組（A）組（P<0.05），與地塞米松組（C）組比較無(wú)明顯差異（P>0.05）；C組較A組升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。③RT-PCR結(jié)果顯示KLF2 mRNA表達(dá)在B組明顯高于A組（P<0.01）及高于C組（P<0.05），C組KLF2 mRNA表達(dá)強(qiáng)于A組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

8、<0.05）；Nrf2 mRNA表達(dá)在B組明顯高于A組,（P<0.01）及高于C組（P<0.05），C組Nrf2 mRNA表達(dá)明顯強(qiáng)于A組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；Bach1 mRNA表達(dá)在B組低于A組和C組（P均<0.05）；C組與A組比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；γ-GCS mRNA表達(dá)在B組明顯高于A組和C組（P均<0.05），C組與A組比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。④Western blot結(jié)果顯示KLF2

9、蛋白水平在B組明顯高于A組（P<0.01）及高于C組（P<0.05），C組KLF2蛋白水平表達(dá)強(qiáng)于A組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Nrf2蛋白水平在B組明顯高于A組（P<0.01）及高于C組（P<0.05），C組Nrf2蛋白水平表達(dá)強(qiáng)于A組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）； Bach1蛋白水平在三組間差異微小，無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；γ-GCS蛋白水平在B組高于A組（P<0.05），C組γ-GCS蛋白水平表達(dá)強(qiáng)于A組，有統(tǒng)計(jì)

10、學(xué)差異（P<0.05）。⑤免疫熒光結(jié)果顯示lipo2000載體能有效將對(duì)照空白質(zhì)粒及KLF2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入大鼠支氣管上皮細(xì)胞中，空白質(zhì)粒組（A組）的轉(zhuǎn)染效率是60.4%，KLF2重組質(zhì)粒組（B組）的轉(zhuǎn)染效率為41.6%；RT-PCR結(jié)果顯示B組KLF2 mRNA表達(dá)強(qiáng)于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Western blot結(jié)果顯示B組KLF2蛋白水平明顯高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。⑥RT-PCR結(jié)果顯示Nrf2

11、 mRNA表達(dá)在B組較A組明顯上調(diào)（P<0.01），A組中以 A3 Nrf2 mRNA表達(dá)較其他兩組高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）； Bach1 mRNA表達(dá)在B組與A組中呈弱陽(yáng)性，兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；r-GCS mRNA表達(dá)在B組較A組上調(diào)（P<0.05）, A組和B組中均以（A2和B2） r-GCS mRNA表達(dá)較其他兩組高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。⑦Western blot結(jié)果顯示Nrf2蛋白水平在B

12、組較A組升高（P<0.05），A組和B組中均以（A2和B2）組上調(diào)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Bach1蛋白水平在B組與A組中無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）； r-GCS蛋白水平在B組較A組明顯升高（P<0.01），A組和B組中以（A2和B2）組上調(diào)，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：⑴屋塵螨抗原處理的大鼠支氣管上皮細(xì)胞中存在氧化應(yīng)激及抗氧化基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)，支氣管上皮細(xì)胞在過(guò)敏原致敏的哮喘發(fā)病過(guò)程中可能起著

13、重要的作用。⑵轉(zhuǎn)錄因子KLF2、Nrf2 and Bach1在大鼠支氣管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)下，對(duì)γ-GCS進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)控，在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)平衡方面起著重要的作用。γ-GCS作為一種關(guān)鍵的抗氧化酶，其表達(dá)水平受轉(zhuǎn)錄因子KLF2、Nrf2正調(diào)控，受轉(zhuǎn)錄因子Bach1負(fù)調(diào)控。⑶過(guò)表達(dá)KLF2基因能增加Nrf2活性，并促進(jìn)Nrf2核轉(zhuǎn)位及核內(nèi)表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)其下游靶基因γ-GCS，從而發(fā)揮重要抗氧化應(yīng)激作用。在這次研究中，KLF2與Bach1無(wú)明顯