人支氣管上皮細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)肺成纖維細(xì)胞的作用及調(diào)控機(jī)制.pdf

1、目的：支氣管哮喘常伴有氣道的結(jié)構(gòu)重塑，其典型特征之一是氣道上皮下成纖維細(xì)胞活動(dòng)增強(qiáng)所產(chǎn)生的基膜增厚、氣道順應(yīng)性降低，導(dǎo)致持久性氣道阻力增高，發(fā)生難以逆轉(zhuǎn)的通氣功能損壞。氣道重塑的機(jī)制目前仍不清楚，因此在臨床上難以獲得有效的防治方法。探討氣道重塑的細(xì)胞與分子機(jī)制有重要意義。 本研究假設(shè)，支氣管上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的相互作用平衡有利于維持氣道微環(huán)境結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)態(tài)。在損傷、應(yīng)激等條件下，細(xì)胞間相互作用平衡可能發(fā)生偏離，從而啟動(dòng)重塑機(jī)制

2、。為論證這一假設(shè)，本研究擬建立人支氣管上皮細(xì)胞(HBECs)與人肺成纖維細(xì)胞(HLF)共培養(yǎng)體系，觀察在蛙皮素受體亞型-3(BRS-3)激活、臭氧(O<,3>)應(yīng)激等不同條件下支氣管上皮細(xì)胞對(duì)肺成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成的調(diào)控，并初步探討作用介質(zhì)，從氣道上皮功能穩(wěn)態(tài)新角度認(rèn)識(shí)氣道重塑機(jī)制。 方法： 1．體外培養(yǎng)人支氣管上皮細(xì)胞株，人胚肺成纖維細(xì)胞株，并建立人支氣管上皮細(xì)胞與人胚肺成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)體系。 2．BRS-

3、3激活、O<,3>應(yīng)激支氣管上皮細(xì)胞后與肺成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，用MTT比色法檢測(cè)肺成纖維細(xì)胞及支氣管上皮細(xì)胞的增殖活性，羥脯氨酸試劑盒檢測(cè)成纖維細(xì)胞膠原合成的狀況。 3．為初步探討支氣管上皮細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)成纖維細(xì)胞的作用介質(zhì)，收集支氣管上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液，EIdSA 法及放射免疫分析法檢測(cè)TGF-β<,1>、FNF-α、PGE<,2>含量，并觀察其時(shí)間變化以及其含量與成纖維細(xì)胞活動(dòng)的關(guān)系。 4．為證實(shí)共培養(yǎng)效應(yīng)的重要介質(zhì)為T

4、GF-β<,1>，TGF-β<,1>反義寡核甘酸(ASO)設(shè)計(jì)，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，MTT法檢測(cè)TGF—β<,1> ASO轉(zhuǎn)染的支氣管上皮細(xì)胞對(duì)成纖維細(xì)胞的增殖活性。 5．為觀察支氣管上皮細(xì)胞TGF-β<,l>表達(dá)是否受與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)的影響，用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)單獨(dú)培養(yǎng)的HBECs與共培養(yǎng)的HBECs TGF-β<,1>表達(dá)差異，并進(jìn)行定量分析。 結(jié)果： 1．在正常共培養(yǎng)條件下支氣管上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的增殖活

5、 性相互受到抑制，BRS-3激活、O<,3>應(yīng)激條件下支氣管上皮細(xì)胞對(duì)肺成纖維細(xì)胞增殖與膠原合成的作用由抑制轉(zhuǎn)變?yōu)榇龠M(jìn)。 2．在BRS-3激活、O<,3>應(yīng)激條件下支氣管上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TGF-β<,l>含量高于對(duì)照組，并與成纖維細(xì)胞的增殖與膠原合成呈顯著正相關(guān)。TNF-α分泌量極少，且與成纖維細(xì)胞的增殖與膠原合成相關(guān)性不大。PGE2隨時(shí)間延長(zhǎng)分泌量減少，并與成纖維細(xì)胞的增殖與膠原合成呈顯著負(fù)相關(guān)。兩種處理組TGF-β<,

6、l>、TNF-a、PGE<,2>分泌隨時(shí)間延長(zhǎng)趨勢(shì)各有其特點(diǎn)。 3．TGF—p<,l>ASO轉(zhuǎn)染HBEC<,s>并激活BRS-3后，其對(duì)共培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞的促增殖活性明顯減弱(P<0.01)。 4．相同預(yù)處理?xiàng)l件下，HBECs單獨(dú)培養(yǎng)或共培養(yǎng)時(shí) TGF-β<,l>表達(dá)差異無(wú)顯著性(P>0.05)，說(shuō)明成纖維細(xì)胞對(duì)支氣管上皮細(xì)胞的TGFβ<,l>表達(dá)無(wú)明顯反作用。HBECs單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)O<,3>應(yīng)激明顯促進(jìn)TGF-β<,l>

7、表達(dá)(P<0.05)；而在共培養(yǎng)條件下用P3513激活BRS-3、O<,3>應(yīng)激均可使TGF-β<,l>表達(dá)增多(P<0.05)。 結(jié)論： 1．在正常條件下支氣管上皮細(xì)胞與肺成纖維細(xì)胞的增殖活性相互抑制，O<,3>應(yīng)激及BRS-3激活可使上皮細(xì)胞對(duì)成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成的抑制作用轉(zhuǎn)化為促進(jìn)作用。 2．O<,3>應(yīng)激及BRS-3激活的支氣管上皮細(xì)胞TGF-β<,l>分泌增多、PGE<,2>合成減少，是引起成纖維細(xì)