Th2-Th17偏轉(zhuǎn)微環(huán)境對人支氣管上皮細(xì)胞重塑的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、背景:重癥哮喘是一種以CD4+T淋巴細(xì)胞中Th2和Th17細(xì)胞分化占優(yōu)勢及氣道重構(gòu)為特點(diǎn)的慢性炎癥性疾病。研究表明氣道重構(gòu)并非只是炎癥細(xì)胞參與的結(jié)果，一些非炎性細(xì)胞如氣道上皮細(xì)胞也扮演重要角色。在內(nèi)外環(huán)境中各種刺激下，氣道上皮細(xì)胞發(fā)生損傷、異常修復(fù)反應(yīng)及細(xì)胞可塑性改變即通過“上皮重塑”來促進(jìn)哮喘氣道重構(gòu)。
　　上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)是上皮重塑的典型表現(xiàn)之一，目前異常的EMT是哮喘氣道重構(gòu)機(jī)制研究的新熱點(diǎn)。在重癥哮喘患者氣道中Th2

2、和Th17源性細(xì)胞因子所介導(dǎo)的微環(huán)境對哮喘氣道上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)變的作用尚不明確。因此探討這些因子對氣道上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)變的作用及其分子機(jī)制，有助于揭示上皮重塑在重癥哮喘氣道重構(gòu)中的作用。在此基礎(chǔ)上探尋逆轉(zhuǎn)上皮重塑的可能途徑，具有重要的學(xué)術(shù)價(jià)值和臨床應(yīng)用前景。
　　目的:研究IL-4/IL-17A介導(dǎo)的Th2/Th17偏轉(zhuǎn)微環(huán)境對氣道上皮重塑的影響。并探討其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及逆轉(zhuǎn)上皮重塑的可能途徑。
　　方法:
　　1.TGF-

3、β1、IL-4和IL-17A對氣道上皮細(xì)胞的增殖抑制作用:以人支氣管上皮細(xì)胞株16-HBE細(xì)胞為研究對象，采用CCK-8法檢測TGF-β1、IL-4和IL-17A對16-HBE細(xì)胞上清液中OD值的影響。
　　2.IL-4/IL-17A介導(dǎo)的Th2/Th17偏轉(zhuǎn)微環(huán)境對氣道上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)變的影響:以16-HBE細(xì)胞為研究對象，使用光學(xué)顯微鏡觀察TGF-β1、IL-4和IL-17A作用下16-HBE細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化;采用免疫細(xì)胞化學(xué)法

4、檢測TGF-β1、IL-4和IL-17A作用下16-HBE細(xì)胞中a-SMA蛋白表達(dá)水平的變化;采用RT-PCR、Western Blot方法檢測TGF-β1、IL-4和IL-17A作用下16-HBE細(xì)胞中上皮-鈣粘蛋白(E-cad)、α-平滑肌肌動蛋白(a-SMA) mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化;采用ELISA法檢測TGF-β1、IL-4和IL-17A作用下16-HBE細(xì)胞上清液中Ⅰ型前膠原氨基端原肽(PINP)表達(dá)水平的變化。

5、　　3.TGF-β1、IL-4和IL-17A在促氣道上皮EMT中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究:以16-HBE細(xì)胞為研究對象，采用Western Blot方法檢測不同時(shí)間點(diǎn)TGF-β1、IL-4和IL-17A作用下16-HBE細(xì)胞中EGFR和p-EGFR、Smad3和p-Smad3、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平的變化;使用U0126(ERK途徑拮抗劑)抑制TGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激所誘導(dǎo)的16-HBE細(xì)胞中ERK1/

6、2活化，采用RT-PCR、Western Blot方法觀察U0126在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變中的作用。
　　4.PPAR-γ激動劑抑制氣道上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)變的研究:使用PPAR-γ激動劑羅格列酮(RGZ)干預(yù)TGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激所誘導(dǎo)的16-HBE細(xì)胞，采用RT-PCR、Western Blot探討羅格列酮對氣道上皮EMT的作用及可能機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1.TGF-β1、IL-4和IL-17A對氣道上皮

7、細(xì)胞的增殖抑制作用。
　　使用相應(yīng)的刺激因子干預(yù)24小時(shí)，陽性對照組（含10％FCS的MEM培養(yǎng)液）能明顯促進(jìn)16-HBE細(xì)胞OD值增高（1.1014±0.0529），陰性對照組（含1％FCS的MEM培養(yǎng)液）中16-HBE細(xì)胞OD值較低（0.4446±0.0317），兩者相比，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有明顯差異(P＜0.0001);單獨(dú)給予0、1、5、10、20ng/mlTGF-β1處理16-HBE細(xì)胞，細(xì)胞上清液OD值未見明顯變化（OD值:0

8、.4453±0.031，0.4445±0.0331，0.4358±0.032，0.4171±0.0264; P=0.198）;單獨(dú)給予0、1、5、10、20ng/ml IL-4刺激16-HBE細(xì)胞，細(xì)胞上清液OD值未見明顯變化(OD值:0.4399±0.0263，0.4381±0.0296，0.4491±0.0299，0.4398±0.0261;P=0.836);單獨(dú)給予0、1、5、10、20ng/ml IL-17A刺激16-HBE細(xì)胞

9、，隨著干預(yù)藥物濃度的增加，其OD值逐漸增高（OD值:0.4428±0.0324，0.4649±0.0199，0.5772±0.0592，0.6735±0.0558），各濃度組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.0001)，10或20ng/mlIL-17A可明顯促進(jìn)16-HBE細(xì)胞的增殖，與0、1、5ng/ml比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而0、1、5ng/ml各組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);給予10ng/mlTGF-β1、

10、IL-4和IL-17A共同刺激，所測得的OD值增高(OD:0.816±0.0559)，統(tǒng)計(jì)分析顯示與不同濃度的單個(gè)因子干預(yù)組(0、1、5、10、20)相比有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，提示給予TGF-β1、IL-4、IL-17A聯(lián)合刺激時(shí)，有協(xié)同作用，能明顯促進(jìn)16-HBE細(xì)胞增殖。
　　2.IL-4/IL-17A介導(dǎo)的Th2/Th17偏轉(zhuǎn)微環(huán)境對氣道上皮EMT的影響。
　　(1)在光學(xué)顯微鏡下，對照組細(xì)胞呈典型的上皮細(xì)

11、胞外觀即鵝卵石狀;單獨(dú)給予10ng/mlIL-4或IL-17A刺激72小時(shí)后，16-HBE細(xì)胞形態(tài)無明顯變化;單獨(dú)給予10ng/ml TGF-β1刺激后，16-HBE細(xì)胞形態(tài)由鵝卵石向梭狀、紡錘形轉(zhuǎn)變，細(xì)胞之間的連接變得松散，細(xì)胞間間隙增大。當(dāng)多個(gè)因子聯(lián)合刺激時(shí)，IL-4+IL-17A未能誘導(dǎo)16-HBE細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化;TGF-β1+IL-4或TGF-β1+IL-17A一起作用時(shí)，可誘導(dǎo)16-HBE細(xì)胞發(fā)生類似TGF-β1組的變化

12、;而TGF-β1+IL-4+IL-17A一起作甩時(shí)較TGF-β1組細(xì)胞形態(tài)變化更加顯著。
　　(2)在正常氣道上皮細(xì)胞中a-SMA低表達(dá)，而發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變的細(xì)胞中a-SMA表達(dá)增高。使用各干預(yù)因素作用72小時(shí)后，應(yīng)用細(xì)胞免疫化學(xué)法觀察到空白組和對照組之間a-SMA表達(dá)（棕黃色顆粒）的平均灰度無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);10ng/mlTGF-β1組與對照組比較，16-HBE細(xì)胞胞漿內(nèi)a-SMA表達(dá)（棕黃色顆粒）明顯增加，差異

13、具有顯著性(P＜0.05);10ng/mlIL-4組與對照組比較，a-SMA表達(dá)（棕黃色顆粒）輕度增加與正常對照組相比，差異具有顯著性(P＜0.05);10ng/mlIL-17A處理的16-HBE細(xì)胞胞漿內(nèi)a-SMA表達(dá)（棕黃色顆粒）的平均灰度無明顯變化，與對照組比較，差異無顯著性(P＞0.05)。當(dāng)多個(gè)因子聯(lián)合刺激時(shí)，10ng/ml TGF-β1+IL-4或10ng/ml TGF-β1+IL-17A或10ng/ml IL-4+ IL-

14、17A處理的16-HBE細(xì)胞胞漿內(nèi)a-SMA表達(dá)（棕黃色顆粒）的平均灰度明顯增加，與正常對照組相比，差異具有顯著性(P＜0.05);而10ng/ml TGF-β1+IL-4+IL-17A共同作用組與對照組相比，差異具有顯著性(P＜0.05);與其他作用組比較，a-SMA表達(dá)進(jìn)一步增加，差異具有顯著性(P＜0.05)，提示TGF-β1、IL-4和IL-17A共同作用于16-HBE細(xì)胞，能進(jìn)一步增強(qiáng)TGF-β1誘導(dǎo)16-HBE細(xì)胞發(fā)生EMT

15、的作用。
　　(3)使用各刺激因子干預(yù)24小時(shí)，RT-PCR結(jié)果顯示單個(gè)刺激因子作用時(shí)，10ng/mlTGF-β1組較對照組16-HBE細(xì)胞中E-cad mRNA表達(dá)水平降低，α-SMA mRNA表達(dá)水平增高，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.10);與對照組比較，10ng/ml IL-4組沒有明顯影響16-HBE細(xì)胞中E-cad mRNA表達(dá)水平，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.577)，輕度促進(jìn)α-SMA mRNA的表達(dá)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)

16、意義(P=0.082);10ng/mlIL-17A組較對照組16-HBE細(xì)胞中E-cad mRNA表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005);沒有影響α-SMA mRNA表達(dá)水平，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.577)。當(dāng)多個(gè)因子聯(lián)合刺激時(shí)，與對照組相比，10ng/mlTGF-β1+IL-4或10ng/mlTGF-β1+IL-17A或10ng/mlIL-4+IL-17A可降低16-HBE細(xì)胞E-cad mRNA表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

17、義(P＜0.05);增加16-HBE細(xì)胞a-SMA mRNA表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。當(dāng)10ng/mlTGF-β1+IL-4+IL-17A三個(gè)因子共同刺激16-HBE細(xì)胞時(shí)，與其他任一干預(yù)因素相比，能進(jìn)一步降低E-cad mRNA表達(dá)水平(P＜0.01);進(jìn)一步增加a-SMA mRNA表達(dá)水平(P＜0.01)。
　　此外，RT-PCR的結(jié)果還顯示10ng/ml TGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激，所誘導(dǎo)

18、16-HBE細(xì)胞EMT呈時(shí)間依賴性，隨著時(shí)間的延長（培養(yǎng)24h、48h、72h）E-cad mRNA的相對表達(dá)量逐漸降低，α-SMAmRNA的相對表達(dá)量隨著時(shí)間的延長逐漸增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0.05)。
　　使用刺激因子干預(yù)72小時(shí)，Western Blot結(jié)果顯示，單個(gè)刺激因子作用時(shí)，10ng/mlTGF-β1組較對照組16-HBE細(xì)胞E-cad蛋白表達(dá)水平降低，α-SMA蛋白表達(dá)水平增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05

19、);與對照組比較，10ng/mlIL-4組沒有影響16-HBE細(xì)胞E-cad蛋白表達(dá)水平，兩者間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.68)，但增加α-SMA蛋白表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);10ng/mlIL-17A組較對照組16-HBE細(xì)胞中E-cad蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但沒有影響α-SMA蛋白表達(dá)水平，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.24)。當(dāng)多個(gè)因子聯(lián)合刺激時(shí)，與對照組相比，10ng/mlTGF-β1+I

20、L-4或10ng/mlTGF-β1+IL-17A或10ng/mlIL-4+IL-17A均可降低16-HBE細(xì)胞E-cad蛋白表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，增加16-HBE細(xì)胞a-SMA蛋白表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001);當(dāng)10ng/mlTGF-β1+IL-4+IL-17A三個(gè)因子共同刺激16-HBE細(xì)胞時(shí)，與其他干預(yù)因素相比，能進(jìn)一步降低E-cad蛋白表達(dá)水平(P＜0.01)，進(jìn)一步增加a-SMA蛋白表達(dá)水

21、平(P＜0.001)。
　　(4)使用刺激因子干預(yù)72小時(shí)，ELISA檢測結(jié)顯示單個(gè)刺激因子作用時(shí)，與對照組相比，10ng/mlTGF-β1組或IL-4或IL-17A組均能促進(jìn)16-HBE細(xì)胞培養(yǎng)上清液中PINP水平增高，不同干預(yù)組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.001），其中TGF-β1作用最顯著(P＜0.001)。當(dāng)多個(gè)因子聯(lián)合刺激時(shí)，與TGF-β1組相比，10ng/mlTGF-β1+IL-4或10ng/mlTGF-β1+IL-1

22、7A或10ng/mlIL-4+IL-17A或10ng/mlTGF-β1+ IL-4+IL-17A均未能進(jìn)一步增加16-HBE細(xì)胞培養(yǎng)上清液中PINP水平(P＜0.01)。
　　3.TGF-β1/IL-4/IL-17A在促氣道上皮EMT中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究。
　　(1)Western Blot結(jié)果表明TGF-β1、IL-4、IL-17A和TGF-β1/IL-4/IL-17A聯(lián)合刺激均沒有影響EGFR、Smad3、ERK1/2的

23、基礎(chǔ)表達(dá)。使用刺激因子干預(yù)5或60分，與對照組比，TGF-β1、IL-4、IL-17A和TGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激均沒有影響p-EGFR/EGFR比值(P＞0.05);與對照組比，給予刺激5分鐘，TGF-β1能增高p-Smad3/Smad3比值(P=0.008)，給予刺激60分鐘，p-Smad3/Smad3比值進(jìn)一步增高(P＜0.001)，而IL-4、IL-17A及TGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激5或60分

24、鐘p-Smad3/Smad3比值無明顯變化(P＞0.05)。與對照組比，TGF-β1、IL-4、IL-17A和TGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激均能增高(p-ERK1/2)/(ERK1/2)比值，各組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001)，其中TGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激對(p-ERK1/2)/(ERK1/2)比值的增高作用最顯著(p＜0.05);TGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激對(p-ERK1/2)/

25、(ERK1/2)比值增加呈時(shí)間依賴性(P＜0.05)。
　　(2)Western Blot結(jié)果顯示20μM U0126明顯抑制TGF-β1/IL-4/IL-17A共同作用所活化的ERK1/2信號通路(P=0.001)。U0126能恢復(fù)TGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激所降低的E-cad蛋白水平(P＜0.001)，降低其所誘導(dǎo)的a-SMA蛋白水平(P＜0.001)。這些結(jié)果說明TGF-β1，IL-4和IL-17A通過活化1

26、6-HBE細(xì)胞中的ERK1/2信號通路促進(jìn)EMT。
　　4.PPAR-γ激動劑羅格列酮抑制氣道上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)變的研究。
　　(1)使用刺激因子干預(yù)72小時(shí)，RT-PCR結(jié)果顯示與對照組相比，10μMRGZ自身不能影響16-HBE細(xì)胞中E-cad(P=0.788)和α-SMAmRNA的基礎(chǔ)水平(P=0.949);10ng/ml TGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激能降低16-HBE細(xì)胞E-cad mRNA表達(dá)水平(P＜

27、0.001)，增加α-SMA mRNA表達(dá)水平(P＜0.001);與TGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激組比，10μM RGZ能部分逆轉(zhuǎn)其作用，增加E-cad mRNA表達(dá)水平(P＜0.001)，降低α-SMA mRNA表達(dá)水平(P＜0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　使用刺激因子干預(yù)72小時(shí)，Western Blot結(jié)果顯示，與對照組相比，10μM RGZ自身，不影響16-HBE細(xì)胞中E-cad(P=0.713)和α-

28、SMA蛋白的基礎(chǔ)水平(P=0.629);10ng/ml TGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激能降低16-HBE細(xì)胞E-cad蛋白表達(dá)水平(P＜0.001)，增加α-SMA蛋白表達(dá)水平(P=0.001)。與TGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激組比，10μM RGZ能增加E-cad蛋白表達(dá)水平(P＜0.001)，降低α-SMA蛋白表達(dá)水平(P=0.002)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以上結(jié)果提示RGZ能逆轉(zhuǎn)TGF-β1、IL-4和I

29、L-17A共同刺激所誘導(dǎo)的16-HBE細(xì)胞EMT。
　　(2)Western Blot結(jié)果顯示10μM RGZ明顯抑制TGF-β1/IL-4/IL-17A聯(lián)合作用所活化的ERK1/2信號通路(P=0.001)。與對照組相比，TGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺激組降低16-HBE細(xì)胞中E-cad蛋白水平，增加α-SMA蛋白水平，與前文的結(jié)果類似，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。與TGF-β1、IL-4和IL-17A共同刺

30、激組比較，10μM RGZ，20μM U0126，10μM RGZ+20μM U0126能部分逆轉(zhuǎn)其作用，增加16-HBE細(xì)胞中E-cad蛋白表達(dá)水平，降低α-SMA蛋白表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001);但三組間所產(chǎn)生的效應(yīng)基本類似，三者間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)
　　結(jié)論:
　　(1) Th2源性因子IL-4、Th17源性因子IL-17A和致纖維化介質(zhì)TGF-β1共同作用的微環(huán)境能直接促進(jìn)氣道上皮細(xì)胞增殖。