S1PR1調(diào)控不同毒力新城疫病毒誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的機(jī)制研究.pdf

1、新城疫（Newcastle Disease,ND）是由新城疫病毒（NewcastleDisease Virus,NDV）引起的一種以禽類呼吸道、消化道黏膜出血為特征的急性、烈性、敗血性傳染病。NDV感染引起機(jī)體各組織不同程度的滲出性炎癥，反映了NDV致病能力的高低，然而目前對(duì)其炎癥反應(yīng)的機(jī)制尚不清楚。1-磷酸鞘氨醇受體1（Sphingosine-1-phosphate receptor1，S1PR1）是病毒誘導(dǎo)的炎癥致病中關(guān)鍵的免疫調(diào)節(jié)

2、因子，關(guān)于禽類S1PR1分子的功能研究鮮見報(bào)道，雞S1PR1在ND炎癥反應(yīng)的功能值得探討。本研究分別以強(qiáng)、弱NDV毒株感染雞胚成纖維細(xì)胞（DF-1）、雞髓樣樹突狀細(xì)胞（mDCs）和SPF雞為模型，通過(guò)體內(nèi)和體外試驗(yàn)綜合比較不同毒力NDV感染引起的炎癥反應(yīng)及S1PR1的表達(dá)差異；在此基礎(chǔ)上，研究S1PR1調(diào)控NDV引起宿主炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制，為臨床上控制NDV感染引起的炎癥反應(yīng)及應(yīng)用免疫調(diào)節(jié)性藥物防治ND提供理論指導(dǎo)。
　　本研究主

3、要內(nèi)容如下：
　　1.不同毒力新城疫病毒感染引起的雞炎癥反應(yīng)及雞S1PR1基因的表達(dá)
　　本研究首先選取2株生物學(xué)特性差異較大的NDV毒株GM株和LaSota株感染SPF雞，觀察不同毒株引起的炎癥表現(xiàn)，并通過(guò)熒光定量PCR對(duì)促炎性細(xì)胞因子IL-1β的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行分析。強(qiáng)毒株GM株感染后表現(xiàn)出滲出性炎癥癥狀，感染雞呼吸道出現(xiàn)大量黏液，消化道有明顯的出血點(diǎn)；而La Sota株僅表現(xiàn)出輕微的呼吸道癥狀。組織切片觀察可見，在GM株感染雞

4、的腦、肺臟、脾臟和腺胃中出現(xiàn)出血和大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等炎性顯微病理變化，La Sota株僅有少量炎性細(xì)胞聚集。GM株在小腸、腦、法氏囊、腺胃和盲腸扁桃體中增殖顯著上調(diào)，依次為27.5倍、14倍、5.6倍、3.8倍和3.5倍；La Sota株僅在腦中增殖水平較高（6.8倍）。在感染組臟器中檢測(cè)到IL-1β的上調(diào)表達(dá)，GM組高達(dá)8.7倍，La Sota組達(dá)到6.4倍，GM組的表達(dá)水平達(dá)顯著高于La Sota組。NDV感染后S1PR1在腦、肝臟

5、、腺胃和法氏囊中表達(dá)量較高，最高可達(dá)6倍（腦），最低為2倍（法氏囊）；在腎臟、小腸和胰腺等組織中表達(dá)下調(diào)。為研究雞S1PR1的功能，本研究從DF-1細(xì)胞中擴(kuò)增了雞S1PR1基因，并構(gòu)建了真核表達(dá)載體pCI-S1PR1，在DF-1細(xì)胞中雞S1PR1基因得到了有效的表達(dá)。
　　2.S1PR1參與調(diào)控NDV誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)
　　為探究S1PR1與NDV炎癥的關(guān)系，本研究檢測(cè)了NDV感染后DF-1細(xì)胞中炎性細(xì)胞因子及S1PR1的表達(dá)：

6、GM感染后IL-1β、IL-6和IL-18表達(dá)顯著上調(diào)，依次達(dá)22倍、41倍和5.5倍，La Sota株感染組與對(duì)照組無(wú)顯著差異，僅有2倍、1.2倍和1.5倍上調(diào)；GM感染誘導(dǎo)IL-8和CCL548倍和9.2倍的上調(diào)表達(dá)，La Sota株感染組也有8.5倍和4.3倍上調(diào)表達(dá)，顯著高于對(duì)照組；TNF-α在La Sota組后呈2.8倍的上調(diào)表達(dá)，而GM組表達(dá)下調(diào)。GM株感染引起S1PR1基因2.5倍的上調(diào)表達(dá)，而La Sota株感染后S1P

7、R1的表達(dá)水平無(wú)顯著差異；NDV感染3 h起，可在感染細(xì)胞中檢測(cè)到S1PR1的蛋白表達(dá)，且GM組表達(dá)水平高于La Sota組。使用W146抑制S1PR1基因表達(dá)后，顯著下調(diào)IL-6（40倍）和IL-1β（10倍）的轉(zhuǎn)錄和160 pg/mL、250 pg/mL蛋白表達(dá)。S1PR1過(guò)表達(dá)顯著上調(diào)NDV誘導(dǎo)的IL-1β的基因轉(zhuǎn)錄（5倍）和蛋白表達(dá)水平（250 pg/mL），下調(diào)IL-6的表達(dá)210 pg/mL。抑制或過(guò)表達(dá)S1PR1基因不影響

8、NDV的復(fù)制與增殖。
　　3.S1PR1調(diào)控新城疫病毒感染引起炎性反應(yīng)的信號(hào)通路研究
　　為進(jìn)一步研究S1PR1對(duì)NDV炎癥反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制，選擇與誘導(dǎo)IL-1β表達(dá)相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB開展研究。本研究利用NDV強(qiáng)毒GM株感染DF-1細(xì)胞，在GM株感染早期RelA/p65的表達(dá)水平顯著上調(diào)，在感染3 h其mRNA水平達(dá)到6.7倍，至感染6 h達(dá)到最高峰（10.8倍），后呈下降趨勢(shì)，感染24h其表達(dá)水平與未感染組無(wú)顯著差異

9、；NDV感染后細(xì)胞熒光素酶值顯著上調(diào)，高于對(duì)照組12倍；在感染3 h其蛋白表達(dá)水平最高，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低。W146處理后，NDV感染引起的NF-κB轉(zhuǎn)錄顯著下調(diào)，比DMSO處理組降低了10倍；其熒光素酶值顯著下調(diào)了1.5倍。此外，W146處理組NF-κB的蛋白表達(dá)水平和亞細(xì)胞定位情況與DMSO處理組無(wú)顯著差異。由于NF-κB的激活還需要IκB蛋白的磷酸化等過(guò)程，因此，本研究對(duì)于S1PR1能否調(diào)控NF-κB信號(hào)通路還不能提供明確

10、的結(jié)論，具體通路有待研究。
　　4.不同毒力NDV誘導(dǎo)的雞DC細(xì)胞炎癥反應(yīng)
　　為了更加全面地研究NDV感染引起的雞炎癥反應(yīng)，本研究選擇具有抗原遞呈功能的樹突狀細(xì)胞（DC）作為模型，研究NDV在其中的炎性反應(yīng)。首先從雛雞骨髓中分離單核細(xì)胞，利用GM-CSF和IL-4在體外誘導(dǎo)分化成DC。根據(jù)細(xì)胞分化周期和病毒感染特性，在細(xì)胞培養(yǎng)第3天分別接種NDV毒株GM株和La Sota株，檢測(cè)NDV復(fù)制以及炎性細(xì)胞因和S1PR1的表達(dá)。

11、結(jié)果顯示，NDV在DC中能夠有效復(fù)制并形成細(xì)胞病變，GM株最高滴度可達(dá)107.2TCID50/100μL，與La Sota株最高峰值差約為10000倍。GM組感染后IL-1β（10.2倍）、IFN-β（7.6倍）和CCL5（35.4倍）的表達(dá)顯著上調(diào)；而La Sota株誘導(dǎo)IL-10表達(dá)（峰值為7.5倍），上調(diào)CCL5表達(dá)（14.3倍）。S1PR1基因在DC細(xì)胞中呈下調(diào)表達(dá)。
　　本研究從NDV感染過(guò)程中機(jī)體免疫和病毒感染的動(dòng)態(tài)變