MG53上調(diào)正常和缺氧復(fù)氧損傷的新生大鼠心肌細(xì)胞瞬間外向K+電流.pdf

1、Mitsugmin53(MG53),是一種肌特異性的RBCC/TRIM家族成員,又稱為TRIM72蛋白。RBCC/TRIM家族蛋白的氨基端有三個(gè)高度保守的序列組成,分別是環(huán)指結(jié)構(gòu),鋅指結(jié)構(gòu)(B-box)和螺旋結(jié)構(gòu),在它的羧基端包含著PRY、SPRY等結(jié)構(gòu)域,與人類的很多疾病的形成有關(guān),可能參與到癌癥形成,病毒感染等病理過程中。MG53蛋白特異性的在骨骼肌和心肌細(xì)胞中表達(dá),主要以小囊泡的形式存在。大量研究表明MG53與細(xì)胞膜的損傷修復(fù)密切

2、相關(guān),一旦細(xì)胞膜發(fā)生損傷,MG53就會(huì)聯(lián)合caveolin-3(小窩蛋白3),通過感知細(xì)胞內(nèi)的氧化環(huán)境的變化,促進(jìn)帶有MG53的小囊泡向受損的部位募集并從細(xì)胞膜出芽,從而以膜片的方式進(jìn)行修復(fù)。有研究報(bào)道,在心肌缺血再灌注損傷過程中,MG53能通過介導(dǎo)損傷細(xì)胞膜修復(fù)作用來對(duì)心肌起一個(gè)保護(hù)作用,同時(shí)在心肌缺血預(yù)適應(yīng)這樣一個(gè)保護(hù)心肌過程中,MG53也是一個(gè)重要的參與組成部分。心肌細(xì)胞膜瞬間外向鉀通道(transient outward cha

3、nnel,Ito)是一種電壓依賴性的鉀通道,膜電位去極化時(shí)激活,具有快速激活和快速失活的特性,是構(gòu)成動(dòng)作電位(actionpotential,AP)復(fù)極化1期的主要鉀電流,同時(shí)也是嚙齒類動(dòng)物復(fù)極化的主要鉀電流,其改變對(duì)AP時(shí)程有重要影響,是疾病條件下引起心律失常的重要因?yàn)?。本研究通過模擬臨床上的缺血再灌注,建立缺氧復(fù)氧損傷的細(xì)胞水平模型,來探討MG53對(duì)Ito電流及其對(duì)心電穩(wěn)定性的影響,探索在心肌缺血再灌注過程中,MG53是否能通過介導(dǎo)

4、對(duì)損傷心肌細(xì)胞膜上的離子通道重構(gòu)的修復(fù),而起到心臟保護(hù)作用。為臨床上缺血再灌注等疾病的治療提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。
　　 第一章正常條件下過表達(dá)MG53對(duì)大鼠心肌細(xì)胞膜上瞬間外向鉀通道(Ito)功能的調(diào)節(jié)
　　 本實(shí)驗(yàn)利用腺病毒載體技術(shù),將帶有MG53基因的重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染進(jìn)乳鼠心肌細(xì)胞,使乳鼠心肌細(xì)胞過表達(dá)MG53,從而觀察MG53對(duì)Lto功能的調(diào)控,并探討正常生理?xiàng)l件下MG53對(duì)心肌細(xì)胞上Ito的功能和電生理機(jī)制的調(diào)節(jié)作

5、用。結(jié)果表明:
　　 1.MG53對(duì)瞬間外向鉀通道(Ito)功能的調(diào)節(jié)
　　 1.1.MG53對(duì)瞬間外向鉀通道(Ito)電流密度和門控動(dòng)力學(xué)的影響
　　 乳鼠心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染兩種腺病毒,分別為AdMG53和AdGFP(作為對(duì)照),48h后膜片鉗記錄Ito電流。結(jié)果表明,較AdGFP組相比,AdMG53組Ito電流密度顯著增加,增加了1.9倍(P=0.000<0.05)。即MG53能顯著增加Ito電流密度,但對(duì)Ito通

6、道的激活動(dòng)力學(xué)無顯著影響。AdMG53組在+60mV所產(chǎn)生電流達(dá)到峰值的時(shí)間(time to peak,TTP)較AdGFP組延長(zhǎng),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.168>0.05)。同時(shí),MG53能顯著減慢Ito通道的失活動(dòng)力學(xué),使Ito通道電流衰減的時(shí)間延長(zhǎng)。AdMG53組電流峰值衰減一半的時(shí)間T0.5較AdGFP組顯著延長(zhǎng)(P=0.015<0.05),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 1.2.MG53對(duì)瞬間外向鉀通道(Ito)電壓依賴性激

7、活的影響
　　 AdMG53組電流密度在+10～+90 mV的電壓范圍內(nèi)均顯著高于AdGFP組P<0.05。AdGFP組與AdMG53組電壓依賴性激活曲線無明顯變化,V0.5,act分別為52.85±3.03 mV(n=14)和45.00±3.80 mV(n=10),P=0.116>0.05,k值兩組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明MG53不改變Ito的離子選擇性,MG53對(duì)鉀電流激活曲線無明顯影響。
　　 1.3.MG53對(duì)瞬間

8、外向鉀通道(Ito)電壓依賴性失活的影響
　　 與AdGFP組比,AdMG53組的電壓依賴性失活曲線發(fā)生正向移位,AdGFP組和AdMG53組的V0.5,inact值分別為-23.65±3.35mV(n=9)和-15.13±2.17mV(n=11),t=2.208,P=0.040<0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。k值兩組之間差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.MG53對(duì)瞬間外向鉀通道(Ito)蛋白表達(dá)的影響
　　 Ito由α

9、亞基(主要為Kv4.2)和β亞基(主要為KChIP2)構(gòu)成。本研究同時(shí)觀察了過表達(dá)MG53對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞以下2組蛋白表達(dá)量的影響:KChIP2和Kv4.2。結(jié)果表明,MG53能使乳鼠心肌細(xì)胞上的Ito的β亞基KChIP2蛋白的表達(dá)量顯著增加,增加了3-4倍,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.015<0.05)。但對(duì)Ito的α亞基Kv4.2蛋白的表達(dá)量無顯著影響,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.434>0.05)。結(jié)果表明,MG53上調(diào)Ito的一個(gè)重要機(jī)制

10、是增加其β亞基KChIP2的表達(dá)量。
　　 結(jié)論:
　　 1.MG53能夠增加瞬間外向鉀通道(Ito)電流密度,減慢通道的失活動(dòng)力學(xué),但對(duì)Ito的激活動(dòng)力學(xué),以及電壓依賴性激活無顯著影響。MG53同時(shí)能夠使Ito的電壓依賴性失活曲線發(fā)生顯著正向移位,但不改變Ito的離子選擇性。
　　 2.MG53顯著增加KChIP2的表達(dá)量,但對(duì)Kv4.2蛋白的表達(dá)量無顯著影響,提示MG53上調(diào)Ito的一個(gè)重要機(jī)制是增加Ito的

11、β亞基的表達(dá)。
　　 第二章缺氧復(fù)氧(H/R)損傷對(duì)新生大鼠心肌細(xì)胞膜上瞬間外向鉀通道(Ito)功能的影響
　　 大量研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)缺血,缺氧可以使心肌細(xì)胞膜上的瞬間外向鉀通道(Ito)受到抑制,本實(shí)驗(yàn)通過模擬臨床的缺血再灌注損傷,在乳鼠心肌細(xì)胞上建立有效的缺氧復(fù)氧模型,根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道以及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,建立缺氧4h復(fù)氧4h的缺氧復(fù)氧(H/R)模型,通過記錄Ito電流,來檢測(cè)模型是否成功,并進(jìn)一步從分子水平來探索Ito各亞基

12、的表達(dá)水平變化。
　　 1.缺氧復(fù)氧(H/R)對(duì)瞬間外向鉀通道(Ito)功能的調(diào)節(jié)
　　 1.1.缺氧復(fù)氧(H/R)對(duì)瞬間外向鉀通道(Ito)電流密度和門控動(dòng)力學(xué)的影響
　　 乳鼠心肌細(xì)胞于37℃,5％CO2培養(yǎng)24h后將培養(yǎng)基更換為缺氧液,放置低氧培養(yǎng)箱(37℃,1％O2,25％CO2)培養(yǎng)4h,再更換為復(fù)氧液,放置于37℃,5％CO2培養(yǎng)4h后膜片鉗記錄Ito電流。結(jié)果顯示,缺氧復(fù)氧(H4/R4)組Ito電流

13、密度低于正常(Normal)組,但差異無顯著性。H4/R4組的 TTP較正常組比時(shí)間延長(zhǎng)約3.11 ms,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.185>0.05)。同時(shí),H4/R4組T0.5較正常組比時(shí)間延長(zhǎng)約19.28 ms,但差異無顯著性(P=0.256>0.05)。而兩組細(xì)胞大小的差異有顯著性,H4/R4能使乳鼠心肌細(xì)胞電容(capacitance)顯著增加(P=0.000)。
　　 1.2.缺氧復(fù)氧(H/R)對(duì)瞬間外向鉀通道(It

14、o)電壓依賴性激活的影響
　　 H4/R4組電流密度在+20～+90 mV的電壓范圍內(nèi)均顯著低于Normal組,P<0.05。為觀察H/R對(duì)Ito通道電壓依賴性激活動(dòng)力學(xué)特征的影響,將Ⅰ-Ⅴ曲線的結(jié)果轉(zhuǎn)換成膜電導(dǎo),對(duì)條件刺激電壓作圖,然后采用Boltzmarm方程g/gmax=1/{1+exp(V0.5-V)/k}進(jìn)行擬合,式中得到Ito激活曲線,然后求得V0.5,act(半數(shù)激活電壓)和k(斜率因子)。H4/R4組與Norma

15、l組的V0.5,act無顯著差異(P=0.938>0.05),同時(shí)k值兩組之間也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明H/R不改變的Ito通道的離子選擇,H/R對(duì)Ito電壓激活曲線無明顯影響。
　　 1.3.缺氧復(fù)氧(H/R)對(duì)瞬間外向鉀通道(Ito)電壓依賴性失活的影響
　　 H/R使Ito通道的電壓依賴失活曲線略負(fù)向移位,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。H4/R4組和Normal組的半數(shù)失活電壓V0.5,inact值分別為-29.15±3.28mV(n

16、=7),-23.65±3.35mV(n=9),t=1.152,P=0.269>0.05,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時(shí)兩組之間的K值也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 2.缺氧復(fù)氧(H/R)對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞本身MG53蛋白表達(dá)的影響
　　 將培養(yǎng)24h的心肌細(xì)胞缺氧4h再復(fù)氧4h損傷后,提取細(xì)胞蛋白,根據(jù)BCA法蛋白定量結(jié)果,行 Western Blot檢測(cè),H4/R4組較Normal組相比MG53蛋白表達(dá)量沒有變化,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P=0.085

17、>0.05。結(jié)果表明,缺氧復(fù)氧(H/R)對(duì)心肌細(xì)胞本身的MG53的蛋白表達(dá)并沒有影響。
　　 3.缺氧復(fù)氧(H/R)對(duì)瞬間外向鉀通道(Ito)的主要α亞基和β亞基的基因水平表達(dá)
　　 Ito由α亞基(主要為Kv4.2)和β亞基(主要為KChIP2)構(gòu)成。結(jié)果表明H4/R4能減少Kv4.2和KChIP2的mRNA水平表達(dá)量,H4/R4組較Normal組Kv4.2和KChIP2的mRNA水平表達(dá)量均發(fā)生顯著減少,分別減少了8

18、1％,(P=0.000<0.05)和90％(P=0.002<0.05)。
　　 結(jié)論:缺氧4h后再復(fù)氧4h心肌細(xì)胞本身表達(dá)的MG53未發(fā)生改變,而抑制了瞬間外向鉀電流(Ito)。H/R能使的Ito電流密度減少。同時(shí)TTP和T0.5均延長(zhǎng),即減慢了Ito的激活和失活動(dòng)力學(xué),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外,H/R對(duì)Ito通道電壓依賴性激活和失活曲線無顯著改變,但能使Ito的主要α亞基Kv4.2和主要p亞基KChIP2的mRNA水平表達(dá)下降

19、。
　　 第三章缺氧復(fù)氧損傷下MG53對(duì)大鼠心肌細(xì)胞膜上瞬間外向鉀通道(Ito)重構(gòu)的調(diào)節(jié)作用
　　 根據(jù)之前的結(jié)論,缺氧復(fù)氧(H/R)對(duì)心肌細(xì)胞本身的MG53表達(dá)沒有影響,且缺氧復(fù)氧(H/R)改變了瞬間外向鉀通道(Ito)的電生理特性和其亞基的mRNA水平表達(dá)量,缺氧復(fù)氧過程中,Ito發(fā)生重構(gòu)。在正常情況下過表達(dá)MG53又能上調(diào)Ito,由此本實(shí)驗(yàn)通過在乳鼠心肌細(xì)胞中過表達(dá)MG53,在缺氧復(fù)氧損傷條件下探索MG53在離子

20、通道重構(gòu)中發(fā)生的作用。
　　 1.MG53對(duì)缺氧復(fù)氧條件下?lián)p傷心肌細(xì)胞的瞬間外向鉀通道(Ito)的主要α亞基和β亞基基因水平的影響
　　 Kv4.2和KChIP2分別是Ito通道的主要α亞基和β亞基,乳鼠心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染腺病毒48h后進(jìn)行缺氧復(fù)氧(H/R)處理,提取樣本進(jìn)行Realtime-PCR檢測(cè)Kv4.2和KChIP2的基因水平表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量(即RQ值)。結(jié)果顯示H4/R4M組與H4/R4G組比較,Kv4.2基因的表

21、達(dá)水平未發(fā)生改變,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P=0.577>0.05。而H4/R4M組的KChIP2基因水平的表達(dá)量高于H4/R4G組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.349>0.05)。
　　 2.MG53對(duì)缺氧復(fù)氧條件下?lián)p傷心肌細(xì)胞的瞬間外向鉀通道(Ito)的主要α亞基和β亞基蛋白水平的影響
　　 MG53對(duì)H/R處理過的乳鼠心肌細(xì)胞的Ito的α亞基即Kv4.2的蛋白表達(dá)量沒有影響(P=0.691>0.05)。但能使β亞基KChIP

22、2蛋白表達(dá)量組顯著增加,增加了3-4倍,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005<0.05)。
　　 3.MG53對(duì)缺氧復(fù)氧條件下?lián)p傷的心肌細(xì)胞的瞬間外向鉀通道(Ito)功能的調(diào)控
　　 3.1.MG53對(duì)缺氧復(fù)氧條件下?lián)p傷的心肌細(xì)胞的瞬間外向鉀通道(Ito)電流密度和門控動(dòng)力學(xué)的影響
　　 在缺氧復(fù)氧(H/R)損傷條件下,MG53能Ito電流密度增加,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001<0.05)。同時(shí)在H/R損傷下MG53對(duì)I

23、to通道的激活動(dòng)力學(xué)和失活動(dòng)力學(xué)無顯著影響。H4/R4M組在+60mV所產(chǎn)生電流達(dá)到峰值時(shí)間(time to peak,TTP)較H4/R4G組比無顯著差異,P=0.246>0.05。H4/R4M組電流峰值衰減一半的時(shí)間T0.5較H4/R4G組比沒有顯著差異,P=0.942>0.05,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組細(xì)胞電容大小的無顯著性差異,P=0.089>0.05。
　　 3.2.MG53對(duì)缺氧復(fù)氧條件下?lián)p傷的心肌細(xì)胞的瞬間外向鉀通道(I

24、to)電壓依賴性激活的影響
　　 細(xì)胞鉗制在-80mV,給予250ms,從-40 mV開始以10mV遞增到+90mV的電壓刺激以激活I(lǐng)to。H4/R4M組電流密度在0mV～+90 mV的電壓范圍內(nèi)均顯著高于H4/R4G組P<0.05。在此基礎(chǔ)上,根據(jù)Ⅰ—Ⅴ曲線計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)化激活穩(wěn)態(tài)(gm)的曲線,運(yùn)用Boltzmann公式:G/Gmax=1/{1+exp[-(V-V0.5)/k]}擬合得到激活曲線,其中G/Gmax:通道電導(dǎo)百分?jǐn)?shù)

25、,V:膜電位,V0.5,act半數(shù)最大激活電壓,k:斜率因子。結(jié)果表明H4/R4G組和H4/R4M組之間V0.5,act無顯著性差異(P=0.877>0.05),K值兩組之間也無顯著差異,說明缺氧復(fù)氧(H/R)損傷條件下MG53不改變的Ito通道的離子選擇,且對(duì)Ito電壓依賴性激活曲線無顯著影響。
　　 3.3.MG53對(duì)缺氧復(fù)氧條件下?lián)p傷的心肌細(xì)胞的瞬間外向鉀通道(Ito)電壓依賴性失活的影響
　　 結(jié)果表明,H4/R

26、4M組較H4/R4G組比,Ito電壓依賴性失活曲線發(fā)生正向移位,V0.5,inact值分別為-19.70±2.14mV(n=14),-29.15±3.28mV(n=7),t=2.488,P=0.022<0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。兩組的K值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)論:在缺氧復(fù)氧損傷條件下,過表達(dá)MG53能使缺氧復(fù)氧過程中被抑制的Ito上調(diào)。在Ito的主要α亞基和β亞基的蛋白表達(dá)水平上,過表達(dá)MG53使KChIP2蛋白表達(dá)增加,而對(duì)K