GDF5-L373R突變導(dǎo)致指(趾)骨間關(guān)節(jié)粘連的作用機制研究.pdf

1、生長分化因子5（Growth differentiation factor5，GDF5）又稱軟骨形態(tài)發(fā)生蛋白-1（cartilage-derived morphogenetic protein-1，CDMP-1）或骨形態(tài)發(fā)生蛋白14(bonemorphogenetic protein14，BMP14)，是轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growthfactor-beta，TGF-β）超家族中的一員。GDF5作為機體軟骨形成、骨

2、骼發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子之一，近年來受到了廣泛的研究與關(guān)注。人GDF5基因定位于20q11.2，全長488 kb，編碼501個氨基酸，由位于N端的信號肽、中間的前體肽以及C端的成熟肽三個部分構(gòu)成。GDF5第377-381位氨基酸殘基(RRKRR)為前蛋白轉(zhuǎn)化酶作用位點，前體單肽鏈合成后將通過二硫鍵形成同源二聚體或與其他BMP家族成員形成異源二聚體，而后N端前體蛋白被切除并釋放出C端成熟蛋白，并分泌到細胞外后發(fā)揮其生物學(xué)作用。
　　

3、GDF5是軟骨和骨骼形成的重要調(diào)節(jié)因子，主要表達于胚胎早期的軟骨聚集區(qū)、軟骨膜以及關(guān)節(jié)區(qū)間域。在骨骼發(fā)育初期，GDF5可以促進軟骨細胞在一定部位的聚集與粘附，而后期則能夠刺激軟骨細胞的增生與肥大。GDF5基因突變可以引起多種類型的骨骼發(fā)育不良疾病，近端指（趾）骨間關(guān)節(jié)粘連（Proximal symphalangism，SYM1）就是其中一種。SYM1是一種罕見的常染色體顯性遺傳病，主要由GDF5或其抑制基因NOG突變引起，以肢端骨骼融合

4、和短指（趾）為主要表型，病變多發(fā)生于近節(jié)指骨和中指骨處，表現(xiàn)為近節(jié)指骨變長、中指骨變短、關(guān)節(jié)腔狹窄，使近節(jié)指骨關(guān)節(jié)不能曲伸或曲伸受限，常累及第3、4和5指，還可伴有耳聾、視力發(fā)育異常等其他癥狀。
　　 本課題組在前期收集的一個中國漢族SYM1的家系中確定其致病原因為GDF5c.1118T＞G(p.L373R)突變，迄今為止文獻報道的能夠引起SYM1的GDF5突變共有五種:R438L、E491K、N445K/T和L373R，其中E

5、491K、L373R為中國家系突變，L373R為本課題組首次報道的突變。該突變位于GDF5前體蛋白轉(zhuǎn)化酶作用位點附近，在不同種屬之間具有很高的保守性。為了明確GDF5-L373R突變的致病方式和途徑，我們構(gòu)建了多種表達載體，研究了野生型和突變型GDF5前體蛋白水解效率、成熟蛋白分泌表達量以及軟骨/骨發(fā)育信號通路中相關(guān)信號分子的改變，以探討揭示GDF5-L373R致病新突變導(dǎo)致SYM1的可能作用機制。
　　 材料方法
　　

6、 一、GDF5-L373R突變對GDF5蛋白表達的影響
　　 敲除信號肽的野生型和突變型GDF5真核表達載體(peDNA3.1-GDF5-WTdelsp和peDNA3.1-GDF5-L373Rdelsp)轉(zhuǎn)染COS-7細胞。48小時后提取細胞總蛋白，Western Blot檢測GDF5前體蛋白和GDF5成熟蛋白表達量的變化，并計算成熟蛋白占前體蛋白的百分比數(shù)。
　　 二、GD F5-L373R突變對GDF5蛋白與其受體結(jié)

7、合能力的影響
　　 野生型和突變型GDF5真核表達載體(pcDNA3.1-GDF5-WT和pcDNA3.1-GDF5-L373R)轉(zhuǎn)染HEK-293細胞。48小時后提取細胞總蛋白，采用免疫沉淀技術(shù)將細胞裂解液與GDF5抗體共孵育，通過Western Blot檢測GDF5蛋白與受體BMPRIB結(jié)合能力的變化。
　　 三、GDF5-L373R突變對與軟骨/骨發(fā)育相關(guān)通路因子的影響
　　 野生型和突變型GDF5慢病毒表

8、達載體(LV-GDF5-WT和LV-GDF5-L373R)感染ATDC-5細胞。感染3-4天后，采用RT-PCR和Western Blot技術(shù)分別在RNA和蛋白質(zhì)水平上檢測GDF5、ALP、ColⅡ、p-Smad1/5/8、Smurf1以及ID1的變化。
　　 四、TGF-β/BMP Signal pathway RT2 ProfilerTM PCR Array基因芯片檢測GDF5-L373R突變后相關(guān)基因的差異表達
　　

9、 野生型和突變型GDF5真核表達載體轉(zhuǎn)染ATDC-5細胞。48小時后以Trizol收集細胞，由上海康成生物公司進行TGF-β/BMP Signal pathway RT2 ProfilerTM PCRArray芯片檢測。
　　 五、GDF5-L373R突變蛋白亞細胞定位的研究
　　 分別以pDsRed1-N1-GDF5-WT、pDsRed1-N1-GDF5-L373R載體和pDsRed1-N1空載體轉(zhuǎn)染HEK-293細

10、胞。轉(zhuǎn)染繼續(xù)培養(yǎng)72小時后，熒光顯微鏡下觀察比較各實驗組間熒光分布情況。
　　 實驗結(jié)果
　　 一、GDF5-L373R突變導(dǎo)致GDF5成熟蛋白表達降低vWestern Blot檢測結(jié)果顯示:與野生型相比GDF5-L373R突變后導(dǎo)致GDF5前體蛋白和成熟蛋白表達均明顯降低，但是其成熟蛋白占前體蛋白的百分數(shù)比值卻升高，推測突變可能導(dǎo)致GDF5前體蛋白有效的水解作用上調(diào)。
　　 二、G DF5-L373R突變導(dǎo)致G

11、DF5蛋白與其受體結(jié)合能力下調(diào)
　　 采用免疫沉淀技術(shù)，通過Western Blot檢測GDF5與受體BMPRIB的結(jié)合能力，結(jié)果顯示GDF5-L373R突變導(dǎo)致GDF5蛋白與BMPRIB結(jié)合能力下調(diào)。
　　 三、GDF5-L373R突變對與軟骨/骨發(fā)育相關(guān)信號通路因子的影響
　　 在RNA和蛋白質(zhì)水平上檢測了相關(guān)骨/軟骨發(fā)育信號通路中因子的變化，結(jié)果顯示GDF5-L373R突變后在RNA水平上檢測到Gdf5表達

12、下調(diào)、Alp表達上調(diào);在蛋白質(zhì)水平上檢測到p-Smad1/5/8和ID1表達下調(diào);Smurf1和ColⅡ表達上調(diào)。
　　 四、TGF-β/BMP Signal pathway RT2 ProfilerTM PCR Array基因芯片檢測GDF5-L373R突變后相關(guān)基因的差異表達
　　 基因芯片共檢測了TGF-β/BMP信號通路中84個相關(guān)通路因子，我們重點關(guān)注了前期檢測的Smad信號通路中的相關(guān)因子，經(jīng)驗證基本與我們前

13、期實驗結(jié)果相符。此外，我們還觀察到了p21的差異表達，通過Western Blot在蛋白水平上檢測到突變后p21表達下調(diào)，提示GDF5-373R突變后可能會對細胞增殖能力產(chǎn)生影響。
　　 五、GDF5-L373R突變蛋白亞細胞定位的研究
　　 經(jīng)熒光共聚焦顯微鏡觀察，結(jié)果顯示野生型和突變型GDF5蛋白質(zhì)均定位于細胞漿，沒有檢測到其在細胞核的定位。
　　 結(jié)論：
　　 GDF5-L373R突變由于減弱了與B