GDF5基因突變對間充質(zhì)細(xì)胞向成軟骨細(xì)胞分化的影響及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、論文一 GDF5基因突變對間充質(zhì)細(xì)胞向成軟骨細(xì)胞分化的影響及其作用機(jī)制的研究
　　 生長分化因子5(growth/differentiation factor5，GDF5)又稱軟骨來源形成蛋白1(cartilage-derived morphogenetic protein1，CDMP1)，是骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bonemorphogenetic protein，BMP)家族成員之一，GDF5基因定位于20q11.2，全長488kb

2、，編碼501個氨基酸，由位于N端的信號肽、中間的前體肽以及C端的成熟肽三部分構(gòu)成，GDF5前體單肽鏈合成后，形成同源或異源二聚體，在蛋白水解酶的作用下于RRKRR位點(diǎn)裂解產(chǎn)生成熟肽，分泌到細(xì)胞外發(fā)揮功能。成熟的GDF5與BMP家族其他成員一樣，需要與細(xì)胞膜上的Ⅰ型和Ⅱ型BMP受體(bonemorphogenetic protein receptor，BMPR)結(jié)合，GDF5主要與BMPRⅠ0B結(jié)合，然后活化細(xì)胞內(nèi)的SMAD信號傳導(dǎo)途徑，

3、調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(如SOX9、ID1和RUNX2等)的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控骨和軟骨的發(fā)育。
　　 GDF5主要在肢芽和未來關(guān)節(jié)形成部位聚集的間充質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，促進(jìn)軟骨前體間充質(zhì)細(xì)胞的聚集，調(diào)控其向軟骨細(xì)胞的分化及成熟，是軟骨和骨骼形成的重要調(diào)節(jié)因子。GDF5突變會導(dǎo)致某些與骨骼發(fā)育相關(guān)的遺傳疾病的發(fā)生，近端指(趾)關(guān)節(jié)粘連(Symphalangism，SYMl)就是其中之一。SYM1是一種罕見的常染色體顯性遺傳病，病變一般累及近節(jié)指骨

4、和中指骨，表現(xiàn)為近節(jié)指骨變長，中指骨變短，關(guān)節(jié)腔狹窄，其功能障礙主要包括近節(jié)指(趾)骨關(guān)節(jié)不能曲伸或曲伸受限，常累及第3、4、5指(趾)，還可伴有耳聾、視力異常等其他癥狀，主要由NOG基因或GDF5基因突變引起。迄今為止文獻(xiàn)報道的引起SYM1的GDF5突變共五種：R438L、E491K、N445K/T和L373R，其中L373R為本課題組報道的突變，該突變位點(diǎn)位于GDF5前結(jié)構(gòu)域，Western Blot檢測證實(shí)該突變不影響成熟GDF5

5、的分泌。為了進(jìn)一步闡明GDF5 L373R突變體導(dǎo)致SYM1的致病機(jī)制，我們構(gòu)建了相應(yīng)的真核表達(dá)載體，將野生型和突變型GDF5的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染具有間充質(zhì)干細(xì)胞特性的人臍帶血管周圍細(xì)胞(human umbilical cord perivascular cell，HUCPV細(xì)胞)和小鼠成肌細(xì)胞系C2C12，誘導(dǎo)向成軟骨細(xì)胞方向分化，通過分析野生型和突變型GDF5對SOX9、ID1等與骨和軟骨分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及Ⅱ型膠原(軟骨細(xì)胞特異標(biāo)志分

6、子)表達(dá)的差異，探討突變型GDF5對間充質(zhì)細(xì)胞向成軟骨細(xì)胞分化的影響，進(jìn)而闡明其導(dǎo)致肢端疾病的致病機(jī)制。
　　 材料方法：
　　 1、HUCPV細(xì)胞原代培養(yǎng)及表型鑒定
　　 (1)細(xì)胞原代培養(yǎng)
　　 臍帶離體后剝離Wharton's膠，Ⅰ型膠原酶消化18～24h后，收集細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶中，用84％a-MEM+15%胎牛血清+1%抗生素培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞達(dá)到80～90%匯合度時，胰蛋白酶消化進(jìn)行傳代培養(yǎng)

7、。
　　 (2)表型鑒定
　　 應(yīng)用免疫組化檢測CD34、CD45和CD44分子的表達(dá)情況。
　　 2、GDF5誘導(dǎo)HUCPV細(xì)胞向成軟骨細(xì)胞方向分化的研究
　　 (1)實(shí)時定量RT-PCR檢測Ⅱ型膠原mRNA的表達(dá)。
　　 (2)免疫組化和Western Blot檢測Ⅱ型膠原的表達(dá)。
　　 (3)阿新藍(lán)染色檢測聚集蛋白聚糖的表達(dá)。
　　 3、GDF5 L373R突變體對間充質(zhì)細(xì)胞

8、向成軟骨細(xì)胞分化作用機(jī)制的研究
　　 (1)構(gòu)建突變型GDF5 L373R真核表達(dá)載體，并通過酶切和測序驗(yàn)證編碼序列的正確性。
　　 (2)RT-PCR檢測細(xì)胞內(nèi)源性BMP受體的表達(dá)。
　　 (3)將野生型和突變型GDF5真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HUCPV細(xì)胞和C2C12細(xì)胞，并誘導(dǎo)其向成軟骨細(xì)胞方向分化。
　　 (4)實(shí)時定量RT-PCR技術(shù)檢測Ⅰ、Ⅱ、Ⅹ型膠原及SOX9、ID1、ID2、ID3、RUNX2和M

9、SX2 mRNA水平的表達(dá)。
　　 (5)WesternBlot檢測p-SMAD1/5/8、ID1、SOX9蛋白和Ⅱ型膠原的表達(dá)。
　　 (6)免疫組化檢測Ⅱ型膠原的表達(dá)；阿新藍(lán)染色檢測聚集蛋白聚糖的表達(dá)；茜素紅染色檢測鈣鹽的沉積。
　　 結(jié)果:
　　 1、HUCPV細(xì)胞的形態(tài)觀察和表型鑒定
　　 (1)形態(tài)學(xué)觀察
　　 原代培養(yǎng)細(xì)胞接種24～48h，倒置顯微鏡下即有少量體積較大的單核細(xì)胞

10、貼壁，散在分布。培養(yǎng)4～8天，貼壁細(xì)胞主要為梭形成纖維樣細(xì)胞，形態(tài)相對均一。傳代至第3代后細(xì)胞呈短梭形排列，形態(tài)均一。
　　 (2)表型鑒定
　　 免疫組化結(jié)果表明造血干細(xì)胞表面標(biāo)記分子CD34(一)和CD45(一)，間充質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)記分子CD44(+)，表明獲得的細(xì)胞為間充質(zhì)細(xì)胞。
　　 2、GDF5能夠促進(jìn)HUCPV細(xì)胞向成軟骨細(xì)胞方向分化
　　 (1)形態(tài)學(xué)改變
　　 進(jìn)行體外分化培養(yǎng)后，H

11、UCPV細(xì)胞逐漸由梭型向多角形、多邊形改變，中心細(xì)胞排列緊密，其中GDF5組細(xì)胞改變更為明顯。
　　 (2)RT-PCR檢測Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)
　　 單純條件培養(yǎng)組細(xì)胞在第3天已有少量Ⅱ型膠原mRNA的表達(dá)，且隨培養(yǎng)時間的延長表達(dá)量逐漸升高；條件培養(yǎng)5天，GDF5組的細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)較空載體組和單純條件培養(yǎng)組的細(xì)胞明顯增高。
　　 (3)免疫組化檢測Ⅱ型膠原表達(dá)
　　 單純條件培養(yǎng)組Ⅱ型膠原陽性細(xì)胞率為

12、26.6±4.9%；空載體組為28.3±5.5%，GDF5組為48.6±6.2%，GDF5組明顯高于單純條件培養(yǎng)組和空載體組(P<0.05)；Western Blot結(jié)果顯示GDF5組Ⅱ型膠原表達(dá)明顯高于其他兩組。
　　 (4)阿新藍(lán)染色檢測聚集蛋白聚糖的表達(dá)
　　 單純條件培養(yǎng)組和空載體組聚集蛋白聚糖染色呈弱陽性，GDF5組染色呈強(qiáng)陽性。
　　 3、GDF5 L373R突變體對間充質(zhì)細(xì)胞向成軟骨細(xì)胞分化能力的影

13、響
　　 (1)pcDNA3.1-GDF5L373R載體的構(gòu)建
　　 定點(diǎn)誘變pcDNA3.1-GDF5產(chǎn)生pcDNA3.1-GDF5L373R，序列正確。
　　 (2)RT-PCR檢測細(xì)胞內(nèi)源性BMP受體mRNA的表達(dá)
　　 HUCPV細(xì)胞和C2C12細(xì)胞能夠表達(dá)與GDF5信號傳遞相關(guān)的膜受體(BMPRⅠ A、BMPRⅠ B、BMPRⅡ和ACTRⅡ)，在C2C12細(xì)胞中BMPRⅠ B的表達(dá)量非常低，說明

14、HUCPV細(xì)胞存在GDF5信號傳導(dǎo)所需的受體，C2C12細(xì)胞是BMPRⅠ B缺乏的細(xì)胞。
　　 (3)GDF5 L373R突變體對p-SMAD1/5/8表達(dá)的影響
　　 在HUCPV細(xì)胞和C2C12細(xì)胞中，與轉(zhuǎn)染野生型GDF5的細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)染突變型GDF5的細(xì)胞p-SMAD1/5/8表達(dá)增加。
　　 (4)GDF5 L373R突變體對軟骨分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響
　　 與轉(zhuǎn)染野生型GDF5的細(xì)胞相比較，

15、轉(zhuǎn)染突變型GDF5的HUCPV細(xì)胞SOX9表達(dá)降低，ID1、RUNX2和MSX2表達(dá)增高；轉(zhuǎn)染突變型GDF5的C2C12細(xì)胞Sox9表達(dá)無明顯變化，Id1、Runx2、Id2和Id3表達(dá)增加；Western Blot結(jié)果顯示SOX9和ID1的表達(dá)與實(shí)時定量RT-PCR結(jié)果吻合。
　　 (5)GDF5 L373R突變體對軟骨基質(zhì)成分表達(dá)的影響
　　 與轉(zhuǎn)染野生型GDF5的細(xì)胞相比較，轉(zhuǎn)染突變型GDF5的HUCPV細(xì)胞COL

16、2A1和COL10A1表達(dá)降低；轉(zhuǎn)染突變型GDF5的C2C12細(xì)胞C012a1和Co110a1表達(dá)無明顯變化。Western Blot檢測Ⅱ型膠原的表達(dá)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染突變型GDF5的HUCPV細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)較轉(zhuǎn)染野生型GDF5的細(xì)胞低；在C2C12細(xì)胞中Ⅱ型膠原表達(dá)二者無明顯差異。免疫組化的結(jié)果與Western Blot相似。阿新藍(lán)染色顯示聚集蛋白聚糖在轉(zhuǎn)染突變型GDF5的HUCPV細(xì)胞中為弱陽性，與Ⅱ型膠原表達(dá)趨勢相似：茜素紅染色顯示在轉(zhuǎn)

17、染突變型GDF5的HUCPV細(xì)胞中有少量細(xì)胞團(tuán)被染成紅色，提示有鈣鹽沉積，在轉(zhuǎn)染野生型GDF5的細(xì)胞中未見明顯紅色細(xì)胞團(tuán)。
　　 結(jié)論：
　　 1、GDF5能夠促進(jìn)HUCPV細(xì)胞向成軟骨細(xì)胞方向分化。
　　 2、在間充質(zhì)細(xì)胞聚集過程中，GDF5 L373R突變體通過改變細(xì)胞內(nèi)SMAD1/5/8磷酸化水平，改變了與間充質(zhì)細(xì)胞向成軟骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞方向分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平，使其促進(jìn)向成軟骨細(xì)胞分化的能力相對減

18、弱，而使向成骨細(xì)胞分化的能力相對增強(qiáng)，促進(jìn)軟骨內(nèi)成骨，導(dǎo)致SYM1的表型。
　　 論文二UBE2B基因多態(tài)性與中國東北地區(qū)特發(fā)性男性不育相關(guān)性的研究
　　 全世界育齡夫婦中約有10～15%的人被不孕不育所困擾，其中男性不育因素約占50%，除了涉及解剖、感染、遺傳、免疫和內(nèi)分泌等這些可以解釋的原因外還有約40～50%的患者原因不明，臨床上稱為特發(fā)性男性不育癥。特發(fā)性男性不育癥以生精障礙即精液異常最為常見，包括無精子、少精子

19、、精子活動力弱和精子畸形。目前利用基因多態(tài)性尤其是單核苷酸多態(tài)性(single nueleotidepolymorphisms，SNPs)進(jìn)行男性不育易感基因的篩選工作已經(jīng)有一定進(jìn)展。越來越多的研究表明，一些與精子發(fā)生相關(guān)基因的SNPs與男性不育可能存在關(guān)聯(lián)性。UBE2B蛋白(泛素結(jié)合酶)是泛素途徑的關(guān)鍵蛋白，主要作用是轉(zhuǎn)移活化后的泛素，使之與其底物結(jié)合。研究表明Ube2b基因敲除后小鼠精子頭部形態(tài)異常，鞭毛粗細(xì)不均，精子的活力降低，導(dǎo)

20、致雄性小鼠不育，因此，Ube2b在哺乳動物正常的生精過程中起著很重要的作用。2008年Suryavathi報道UBE2B基因多態(tài)性與印度男性不育密切相關(guān)。本文利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphisms，PCR-RFLP)對UBE2B基因3個SNP的基因型進(jìn)行檢測，并對基因型頻率、等位基因頻率及單體型頻

21、率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以確定UBE2B基因多態(tài)性與東北地區(qū)男性特發(fā)性不育的相關(guān)性。
　　 材料方法：
　　 1、研究對象
　　 符合入選要求的男性不育患者外周血樣本388例，健康已育男性血液樣本312例。根據(jù)精液常規(guī)檢測將病例組分為少弱精癥、重度少弱精癥和無精癥三組。
　　 2、研究方法
　　 (1)血液基因組DNA提取。
　　 (2)常規(guī)PCR擴(kuò)增包含相應(yīng)SNP位點(diǎn)的基因片段。
　　

22、 (3)相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切。
　　 (4)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行基因型分析。
　　 (5)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包，分別對各病例組與對照組進(jìn)行基因型、等位基因頻率及單體型進(jìn)行卡方檢驗(yàn)分析，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、Hardy-Weinberg平衡檢測
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析UBE2B基因g.-293T>G和g.20016A>G位點(diǎn)在所有研究

23、對象中等位基因頻率和基因型頻率，結(jié)果顯示P>0.05說明群體符合Hardy-Weinberg平衡。
　　 2、UBE2B g.-293T>G位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分析
　　 病例組和對照組TG+GG基因型的頻率為8.2%和11.8%，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；3個亞組與對照組比較TG+GG基因型的頻率無明顯差異。病例組和對照組比較，T和G等位基因頻率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 3、UBE2B g.20016A>G位點(diǎn)基因型和等位

24、基因頻率分析
　　 病例組和對照組AG+GG基因型的頻率為16.5%和14.4%，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；3個亞組與對照組比較AG+GG基因型的頻率無明顯差異。病例組和對照組比較，A和G等位基因頻率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是在正常人群中未發(fā)現(xiàn)GG純合基因型，只在無精癥患者中檢出2例。
　　 4、UBE2B g.9157A>G位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分析
　　 在病例組和對照組中均未檢測到g.9157A>G的堿基互換，基因型均為AA

25、型，沒有含G的基因型。
　　 5、單體型分析
　　 病例組和對照組比較，g.-293T>G和g.20016A>G的TA、TG和GG單體型均無明顯差異，只有GA型在正常人群中明顯增高(P=0.003)。3個亞組(少弱精癥、重度少弱精癥和無精癥)分別與正常對照組進(jìn)行比較，單體型TA、TG和GG也無明顯差異，無精癥和少精癥中GA型的比例低于正常組(P=0.007和P=0.04)。
　　 結(jié)論：
　　 1、UBE