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文檔簡介
1、前言:
在真核生物細胞周期的各個事件中,DNA復制過程是一個被嚴格調(diào)控的事件,受到G1/S限制點的檢查,與細胞周期其他事件協(xié)調(diào)發(fā)生。DNA復制的紊亂將直接導致基因組不穩(wěn)定,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展息息相關(guān)。DNA聚合酶alpha-引物酶復合物(DNA polymerase alpha-primase,pol-prim)是負責DNA復制起始的聚合酶。該酶由四個亞基組成,其中p180有聚合酶活性,p70調(diào)控pol-prim活性,p180
2、在整個細胞周期中均處于磷酸化狀態(tài),p70以細胞周期依賴性方式被磷酸化,從而活化pol-prim。周期素(cyclin)E/細胞周期依賴性激酶2(cell cycle dependent kinase2,CDK2)在S期復制起始階段磷酸化p70,激活pol-prim。
口腔癌缺失基因-1相關(guān)基因(deleted in oral cancer-1-related,DOC-1R)是張學教授等發(fā)現(xiàn)的一個抑癌基因。RT-PCR結(jié)果表明,
3、DOC-1R在所檢測的小鼠各組織中普遍表達,在卵母細胞中也有表達,提示DOC-1R可能是哺乳動物的管家基因。本課題組前期工作發(fā)現(xiàn),DOC-1R轉(zhuǎn)基因表達明顯地抑制了細胞體外集落形成能力,提示DOC-1R對細胞增殖有抑制作用。細胞生長曲線和5-溴-2脫氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2deoxyuridine,BrdU)摻入實驗表明,DOC-1R轉(zhuǎn)基因表達能夠抑制體外培養(yǎng)細胞的生長,并明顯抑制其DNA復制過程。
Wong等研究表明
4、DOC-1R的同源蛋白,口腔癌缺失基因-1(deleted in oralcancer-1,DOC-1),能夠分別和pol-prim及CDK2結(jié)合,通過抑制CDK2/cylin E對p70的磷酸化,從而抑制DNA復制起始。氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)在與CDK2及pol-prim兩蛋白結(jié)合區(qū)域,DOC-1蛋白和DOC-1R蛋白的相應(yīng)區(qū)域高度同源。因此,我們推測DOC-1R蛋白可能也結(jié)合CDK2和pol-prim,并抑制兩者活性從而抑制DNA復制起
5、始。本實驗根據(jù)以上假設(shè)展開DOC-1R負性調(diào)節(jié)DNA復制的機理研究。
材料與方法:
1、pLXSN-FLAG-1R及pLXSN-FLAG逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建
兩端帶有EcoR I/BamH I酶切位點的FLAG-DOC-1R以及FLAG插入片段分別通過PCR擴增和人工合成獲得。用EcoR I/BamH I雙酶切消化pLXSN載體及插入片段。連接酶切后的載體和插入片段,并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞,經(jīng)菌落PCR及限制性內(nèi)
6、切酶酶切鑒定得到候選陽性克隆,測序以證實構(gòu)建成功。
2、流式細胞分析儀檢測DOC-1R對細胞周期的影響
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN-FLAG-DOC-1R以及pVSV-G,以LipofeetamineTM2000共轉(zhuǎn)染GP-293細胞,在GP-293細胞中進行病毒包裝。轉(zhuǎn)染48 h后,過濾細胞培養(yǎng)液上清,以收集病毒。HeLa細胞感染病毒48 h后,應(yīng)用PI染料通過流式細胞分析儀檢測實驗組和對照組的細胞周期時相分布,記錄
7、位于各期的細胞百分率。三次結(jié)果取平均值,經(jīng)統(tǒng)計學分析,比較實驗組和對照組細胞周期分布差異。
3、免疫沉淀方法分析DOC-1R與CDK2蛋白的相互作用
逆轉(zhuǎn)錄病毒感染HeLa細胞后48 h裂解細胞,細胞裂解液中加入FLAG抗體,4℃搖動過夜。次日加入30μl protein G Beads混合3h,洗脫液洗Beads5次,后離心沉淀Beads。Western印跡檢測共沉淀的CDK2蛋白。
4、DOC-1R對細
8、胞內(nèi)CDK2蛋白激酶活性的影響
以CDK2抗體經(jīng)免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)從DOC-1R病毒感染細胞裂解液和對照組中純化CDK2蛋白,150μg總蛋白中純化的CDK2蛋白溶解于15μl激酶反應(yīng)緩沖液中,加入ATP與底物histone H1在30℃孵育90 min,加入激酶活性檢測試劑Kinase GloTM室溫孵育10 min后,發(fā)光儀檢測發(fā)光強度,并經(jīng)統(tǒng)計學分析確定DOC-1R表達對CDK2活性
9、的影響。
5、免疫沉淀方法分析DOC-1R與pol-prim p180的相互作用
逆轉(zhuǎn)錄病毒感染HeLa細胞后48 h裂解細胞,細胞裂解液中加入FLAG抗體,4℃搖動過夜。次日加入30μl protein G Beads混合3h,洗脫液洗Beads5次,后離心沉淀Beads。Western印跡檢測共沉淀的pol-prim p180。
6、DOC-1R對pol-prim活性的影響
以p70抗體經(jīng)免疫
10、沉淀從DOC-1R病毒感染組細胞裂解液和對照組細胞裂解液中純化p70蛋白后,以Western印跡分別檢測磷酸化的p70及p70總蛋白。Western印跡結(jié)果經(jīng)灰度值掃描后,以磷酸化p70灰度值相對p70總蛋白灰度值的比值phospho-p70/p70/p70代表相對磷酸化程度,p70的磷酸化程度高則反應(yīng)pol-prim活性強。
實驗結(jié)果:
1、pLXSN-FLAG-DOC-1R和pLXSN-FLAG逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)
11、建
以菌落PCR及限制性內(nèi)切酶酶切鑒定得到候選陽性克隆,測序結(jié)果表明所得到的克隆序列及開放閱讀框架完全正確。
2、流式細胞分析儀檢測DOC-1R對細胞周期的影響
(1)與對照組相比,感染DOC-1R逆轉(zhuǎn)錄病毒的實驗組細胞中,G1期細胞比率增加,S期細胞比率減少。經(jīng)t檢驗分析,其差異具有統(tǒng)計學意義,P<0.05。
(2)M期細胞比率在實驗組與對照組間的差異沒有統(tǒng)計學意義。
3、免疫沉淀證實
12、DOC-1R與CDK2在細胞內(nèi)結(jié)合
以DOC-1R逆轉(zhuǎn)錄病毒感染HeLa細胞,以pLXSN-FLAG產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染對照組HeLa細胞。以抗-FLAG抗體進行免疫沉淀,CDK2抗體進行Western印跡分析。實驗組檢測到CDK2,而對照組未檢測到CDK2蛋白。證明DOC-1R與CDK2在細胞內(nèi)結(jié)合。
4、體外激酶活性檢測表明DOC-1R下調(diào)CDK2的激酶活性
感染DOC-1R逆轉(zhuǎn)錄病毒的細胞中,相對熒光
13、單位(relative light unit,RLU)為17731,感染對照逆轉(zhuǎn)錄病毒細胞的RLU為12283,經(jīng)t檢驗分析,此差異在統(tǒng)計學上具有顯著性,P<0.01。
5、免疫沉淀證實DOC-1R與pol-prim p180在細胞內(nèi)結(jié)合
以DOC-1R逆轉(zhuǎn)錄病毒感染HeLa細胞,以pLXSN-FLAG產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染對照組HeLa細胞。以抗-FLAG抗體進行IP,pol-prim p180抗體進行Western
14、印跡分析。實驗組檢測到pol-prim p180,而對照組未檢測到pol-prim p180蛋白。證明DOC-1R與pol-prim p180在細胞內(nèi)結(jié)合。
6、DOC-1R對pol-prim活性的影響
感染DOC-1R逆轉(zhuǎn)錄病毒的細胞中,phospho-p70/p70比值為0.242;感染對照逆轉(zhuǎn)錄病毒細胞的phospho-p70/p70比值為0.735。經(jīng)t檢驗分析,此差異在統(tǒng)計學上具有顯著性,P<0.01。DO
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