固氮斯氏假單胞菌A1501銨轉(zhuǎn)運(yùn)基因amtB的結(jié)構(gòu)分析和功能研究.pdf

1、固氮斯氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)A1501是一株分離自水稻根際的聯(lián)合固氮細(xì)菌,屬變形細(xì)菌γ亞族.銨轉(zhuǎn)運(yùn)基因(ammonium transporter gene)是生物體細(xì)胞內(nèi)外氮素平衡重要基因,而銨又處于整個(gè)同化代謝的中央位置,因此詳盡研究該基因?qū)τ诠痰饔靡约罢{(diào)節(jié)機(jī)制研究有重要意義.通過對(duì)其全基因組序列分析、設(shè)計(jì)兩對(duì)引物,經(jīng)PCR從野生型A1501中擴(kuò)增出2684bp的片段,經(jīng)過序列比對(duì)和Blast序列比較

2、后確定包含amt完整基因,并且確定該菌含有兩個(gè)緊密連鎖的銨載體基因?yàn)閍mtB1和amtB2,分別包含12和11個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域.并且在兩個(gè)基因之間無啟動(dòng)子和終止子序列,利用RT-PCR方法證實(shí)了這一結(jié)果. 本研究從野生型A1501提取細(xì)菌總DNA,并分別克隆amtB1、amtB2部分片段,連接到自殺質(zhì)粒載體pK18mob或pT18mob上,通過三親接合與野生菌A1501進(jìn)行同源單交換,經(jīng)過抗性篩選獲得了amtB1極性突變株、非極性突

3、變株以及amtB2非極性突變株,分別命名為TB12極性突變株,TB1突變株,TB2突變株. 在高銨條件下測(cè)定細(xì)胞生長曲線發(fā)現(xiàn),所有突變株相對(duì)于野生菌生長表型沒有什么差異,但是在低銨濃度下,TB12極性突變株相對(duì)于野生菌A1501在平板顯示出生長緩慢,而兩個(gè)非極性突變TB1、TB2與野生菌A1501相似.測(cè)定銨吸收實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),突變株TB1、TB2和野生菌胞外銨濃度下降趨勢(shì)相似,而TB12極性突變株胞外銨濃度基本保持不變,證明兩個(gè)銨

4、載體基因突變的確影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)能力.接下來生理實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果顯示:在菌株生長到穩(wěn)定期后,TB12具有一定泌銨能力.當(dāng)amt任何基因的突變后,并未影響到固氮酶活性,但是在固氮條件下,銨激后極性突變株的表型特征與其它菌株不一致,仍能保持比較高的固氮酶活性,而非極性突變和野生菌基本喪失固氮酶活性. 將極性突變株.TB12和野生型A1501接種水稻,研究水稻光合作用和固氮作用之間的互作.結(jié)果表明:施用固氮菌后,對(duì)水稻有明顯的促生作用,但突