固氮施氏假單胞菌RpoN和RpoS對鞭毛合成和趨化調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、在自然界中,為了適應(yīng)復(fù)雜多變的外界環(huán)境,原核生物需要通過誘導(dǎo)不同σ因子來調(diào)控特定基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。σ因子在微生物的進(jìn)化過程中產(chǎn)生了種類和功能上的差異。根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能可將其可分為兩類:σN因子和σ70家族因子。目前研究較為深入的σ因子為σ70、σ54和σ38。對σ因子的研究大多數(shù)都是在轉(zhuǎn)錄組水平上,隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)是一個(gè)十分復(fù)雜的過程,是諸多因素作用的結(jié)果。在原核生物中,其通常以多重調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的方式來調(diào)節(jié)某一外界的刺激應(yīng)答,

2、許多證據(jù)顯示轉(zhuǎn)錄的激活取決于大量的轉(zhuǎn)錄因子的相互作用。在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)多個(gè)σ因子協(xié)同或拮抗調(diào)控趨化、鞭毛合成等某些特殊基因的表達(dá)。假單胞菌中是否存在和大腸桿菌相類似的調(diào)控機(jī)制,目前仍不清楚。本研究以施氏假單胞菌A1501為研究對象,構(gòu)建了rpoN缺失突變株ΔrpoN及其功能互補(bǔ)菌株Comp-rpoN。并利用實(shí)驗(yàn)室已有的rpoS缺失突變株ΔrpoS,就RpoN和RpoS對菌株鞭毛合成與趨化的調(diào)控進(jìn)行了相關(guān)研究。并取得了以下主要結(jié)果:

3、>　　1.利用三親本結(jié)合的方法構(gòu)建了rpoN基因缺失突變株和功能回補(bǔ)株。
　　2.LB培養(yǎng)基中,ΔrpoN生長非常緩慢,穩(wěn)定期的菌體密度只有野生型的50％;Comp-rpoN的生長恢復(fù)到野生型的80%——即rpoN基因突變影響了菌株在正常條件下的生長。而rpoS基因的缺失對菌株生長并沒有顯著的影響。分別以2MNacl沖擊、20mMH2O2沖擊處理,ΔrpoS對鹽沖擊和H2O2沖擊比較敏感,ΔrpoS存活率明顯下降;而以50℃熱沖擊

4、后,ΔrpoS的存活率與野生型沒有明顯差異。
　　3.在固氮條件下,rpoN基因的缺失使得菌體喪失了固氮能力,Comp-rpoN的固氮酶活性僅恢復(fù)到野生型的30%;ΔrpoS的固氮酶活性下降到野生型的75%。
　　4.趨化實(shí)驗(yàn)表明ΔrpoN趨化能力喪失,ΔrpoN喪失了趨化能力,而ΔrpoS趨化能力卻增強(qiáng)了。通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn),rpoN突變株為鞭毛合成缺陷體;rpoS突變后菌體鞭毛與野生型相比更細(xì)、更長。
　　5.通

5、過phyre2分析發(fā)現(xiàn),RpoN蛋白具有7個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)和2個(gè)β折疊結(jié)構(gòu)。RpoN具有三個(gè)功能結(jié)構(gòu)域,C末端具有保守的RpoN-BoX保守序列:421-IAGLLEAQGIQVARRTVAKYRESLGIAPSSERKRLL-457。RpoS蛋白具有14個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)及1個(gè)β折疊結(jié)構(gòu)。該蛋白C端DNA-binding氨基酸序列:286-EASTLEEVGQEIGLTRERVRQIQVEALRRLREILERNGLSSDALFQ-332。通過

6、Weblogo預(yù)測A1501中依賴RpoN啟動(dòng)子保守結(jié)合序列為TGGCACNNNNNTTGC,依賴RpoS啟動(dòng)子保守結(jié)合序列為CTANNNTG。
　　6.利用pTwin1載體構(gòu)建了pT-rpoN融合表達(dá)載體,在大腸桿菌BL21(DE3)中導(dǎo)入pT-rpoN表達(dá)了RpoN蛋白,并以幾丁質(zhì)柱對其進(jìn)行純化。選擇鞭毛等級調(diào)控系統(tǒng)中的關(guān)鍵調(diào)控基因fliA,擴(kuò)增其上游300bp的序列為探針,通過凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其與RpoS結(jié)合。而沒有發(fā)現(xiàn)Rp