施氏假單胞菌海藻糖合酶性質(zhì)及其活性改造的研究.pdf

1、海藻糖是一種非還原性雙糖，它是由兩個(gè)葡萄糖分子通過α,α-1,1-糖苷鍵連接而成。在一些生物體中廣泛存在，對生物體具有非特異性保護(hù)作用。本論文以海藻糖合酶生產(chǎn)菌施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeriQlu3）為研究基礎(chǔ)，通過基因克隆的方法，使其海藻糖合酶基因在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)，并通過實(shí)驗(yàn)對其酶活性性質(zhì)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及海藻糖合酶分子改造進(jìn)行了研究。主要研究結(jié)果包括以下幾個(gè)方面：
　　（1）海藻糖合酶酶學(xué)性質(zhì)的測

2、定：該菌株的海藻糖合酶最適反應(yīng)溫度為35℃；最適反應(yīng)pH值為8.0；1mM的金屬離子對其活性的影響很小，而10mM的Zn2+,Cu2+,Fe2+,Ca2+,Co2+,Mn2+,Ni2+和SDS抑制海藻糖合酶的活性。以150mM麥芽糖為底物，反應(yīng)2小時(shí)就能將72％的麥芽糖轉(zhuǎn)化為海藻糖，而且副產(chǎn)物葡萄糖為3.6%。
　?。?）海藻糖合酶晶體結(jié)構(gòu)的研究：通過對海藻糖合酶的晶體普篩和優(yōu)化，我們拿到了海藻糖合酶的晶體，并收集了一套nativ

3、e的衍射數(shù)據(jù)，由于該海藻糖合酶的序列與已有結(jié)構(gòu)報(bào)道的相似性不足30%，所以在結(jié)構(gòu)解析中需要相位的確定。隨后，我們進(jìn)行了硒代蛋白的提取和晶體的普篩，通過晶體的普篩，獲得了硒代蛋白的晶體，但是衍射的分辨率不足以解析結(jié)構(gòu)，晶體還需要進(jìn)一步的優(yōu)化。
　　（3）海藻糖合酶同源建模及結(jié)構(gòu)改造：通過同源建模及分子對接模擬等生物信息學(xué)的方法，得到了海藻糖合酶與底物復(fù)合物的結(jié)構(gòu)模型，Autodock軟件對酶與底物結(jié)合系統(tǒng)的靈活對接，進(jìn)行研究了海藻糖

4、合酶與底物相互作用方式，并通過生化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證。此外，根據(jù)結(jié)構(gòu)模型，預(yù)測了海藻糖合酶活性中心通道，該通道的打開或者關(guān)閉，以及該通道的大小對于海藻糖合酶反應(yīng)速率起到了關(guān)鍵的作用。生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過截去該通道上的兩個(gè)loop環(huán)導(dǎo)致海藻糖合酶的異構(gòu)酶活的全部喪失；而對該通道上氨基酸突變后，也會(huì)顯著改變海藻糖合酶的酶活，其中Q219R、T308E和L341Q的突變體導(dǎo)致海藻糖合酶異構(gòu)酶活性降低，水解酶活性升高。而A309E突變體則導(dǎo)致異構(gòu)