HMGB1對人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞表達E-選擇素調(diào)控機制的研究.pdf

1、膿毒癥指由感染引起的全身炎癥反應綜合征，其發(fā)生率以每年1.5％-8％遞增，病死率卻無明顯的改善。高遷移率蛋1(HMGB1)是高遷移率族蛋白超家族成員之一，廣泛存在于真核細胞核中最重要的非組蛋白，分子質(zhì)量小，含量豐富，序列高度保守。1999年HMGB1首次報道作為新的潛在的晚期炎癥介質(zhì)參與了膿毒癥的發(fā)病過程，是膿毒血癥晚期的重要炎癥介質(zhì)。血管內(nèi)皮細胞在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。它不僅是膿毒癥時受損的靶細胞，同時還通過其廣泛的生物學

2、功能主動地參與了器官功能的損傷。血管內(nèi)皮細胞受到炎癥刺激時可以釋放HMGB1，促進細胞因子和E--選擇素黏附分子的表達。
　　 E-選擇蛋白(E-selectin)，又稱內(nèi)皮細胞-白細胞粘附分子-1(endothelial-leukocyte adhesion molecule-1，ELAM1)，是一種重要的粘附分子，屬選擇蛋白家族。其表達具有嚴格的細胞特異性，僅發(fā)現(xiàn)其表達于血管內(nèi)皮細胞及經(jīng)特殊處理的血管平滑肌細胞。內(nèi)皮細胞激活

3、時內(nèi)皮細胞表面或血漿中粘附分子表達的增加是各種類型的膿毒癥的典型表現(xiàn)。血漿E-選擇素的水平和膿毒癥患者的SAPSII和MOF評分呈正相關。血漿E-選擇素的增加反應了內(nèi)皮細胞膜表達蛋白的增加，能直接反映內(nèi)皮的激活或功能障礙。胞外HMGB1為一種重要的炎癥介質(zhì)和致炎細胞因子，是啟動和維持炎癥瀑式反應的中心分子，與膿毒癥等的發(fā)病機理關系密切。HMGB1在細胞核內(nèi)的與DNA廣泛的、非特異的結(jié)合，可與一些轉(zhuǎn)錄因子相互作用參與DNA復制、細胞增殖分

4、化、基因轉(zhuǎn)錄等生命活動。Hox基因?qū)儆谕春谢?Homeobox gene)，是與生物體發(fā)育密切相關的重要基因調(diào)控家族。核內(nèi)的HMGB1可以與HOX轉(zhuǎn)錄因子相互作用增強了DNA的結(jié)合能力和轉(zhuǎn)錄活性。有研究發(fā)現(xiàn)，HOXA9參與了內(nèi)皮細胞的E-選擇素轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)且HOXA9下調(diào)是內(nèi)皮細胞激活的必要條件。因此，我們推測核內(nèi)HMGB1可能通過HOXA9激活內(nèi)皮細胞的作用進而調(diào)節(jié)E-選擇素的表達。
　　 本實驗中，我們旨在構(gòu)建短發(fā)夾的HMG

5、B1基因的真核細胞表達載體，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到內(nèi)皮細胞中，觀察其對HOXA9基因和E--選擇素的表達影響，探討HMGB1基因表達對內(nèi)皮細胞激活表達E--選擇素轉(zhuǎn)錄調(diào)控可能的機制。
　　 材料與方法：
　　 一、構(gòu)建短發(fā)夾的HMGB1基因的真核細胞表達載體
　　 根據(jù)人的HMGB1基因的編碼序列，設計3條干擾靶系列和1條對照序列，并在兩端加入酶切位點，將合成的正反向寡核苷酸鏈退火形成雙鏈DNA，并連接到酶切后的pR

6、NA-u6.1/Neo載體上，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)菌，氨芐青霉素抗性篩選，挑去陽性克隆，采用DNA序列分析進行鑒定，構(gòu)建的質(zhì)粒分別命名為pRNA-u6.1/Neo-HMGB1-1,pRNA-u6.1/Neo-HMGB1-2,pRNA-u6.1/Neo-HMGB1-3, pRNA-u6.1/Neo-HMGB1-NC。
　　 二、Realtime—PCR和Western blot檢測重組質(zhì)粒在人的臍靜脈血管內(nèi)皮細胞中干擾

7、HMGB1表達的作用
　　 脂質(zhì)體介導法將pRNA-u6.1/Neo-HMGB1-(1、2、3、NC)分別轉(zhuǎn)染人的臍靜脈血管內(nèi)皮細胞中，轉(zhuǎn)染48小時后收集各組細胞。提取蛋白質(zhì)和RNA，進行western blot和reatime-PCR檢測，篩選重組質(zhì)粒pRNA-u6.1/Neo-HMGB1-(1、2、3、NC)有效干擾HMGB1表達的的靶序列。
　　 三、Realtime—PCR檢測重組質(zhì)粒pRNA-u6.1/Neo-

8、HMGB1在人的臍靜脈血管內(nèi)皮細胞中對HOXA9表達的影響
　　 脂質(zhì)體介導法將pRNA-u6.1/Neo-HMGB1轉(zhuǎn)染人的臍靜脈血管內(nèi)皮細胞中，轉(zhuǎn)染48小時后收集各組細胞。提取RNA，進行Reatime-PCR檢測HOXA9的mRNA的表達。
　　 四、Realtime—PCR檢測重組質(zhì)粒pRNA-u6.1/Neo-HMGB1在人的臍靜脈血管內(nèi)皮細胞中對E-選擇素表達的影響
　　 脂質(zhì)體介導法將pRNA-u6

9、.1/Neo-HMGB1轉(zhuǎn)染人的臍靜脈血管內(nèi)皮細胞中，轉(zhuǎn)染48小時后收集各組細胞。提取RNA，進行Reatime-PCR檢測E-選擇素的mRNA的表達
　　 五、Realtime— PCR和Western blot檢測人工合成的干擾質(zhì)粒SiRNAHOXA9在人的臍靜脈血管內(nèi)皮細胞中干擾HOXA9表達的作用
　　 脂質(zhì)體介導法將SiRNAHOXA9和對照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染人的臍靜脈血管內(nèi)皮細胞中，轉(zhuǎn)染48小時后收集各組細胞。提取

10、蛋白質(zhì)和RNA，進行western blot和reatime-PCR檢測，驗證SiRNAHOXA9干擾HOXA9表達的效應。
　　 六、Realtime-PCR檢測pRNA-u6.1/Neo-HMGB1和SiRNAHOXA9共同在人的臍靜脈血管內(nèi)皮細胞中對E-選擇素表達的影響
　　 脂質(zhì)體介導法將pRNA-u6.1/Neo-HMGB1和SiRNAHOXA9共同轉(zhuǎn)染人的臍靜脈血管內(nèi)皮細胞中，轉(zhuǎn)染48小時后收集各組細胞。提取

11、RNA，進行Reatime-PCR檢測的E-選擇素mRNA的表達。
　　 七、統(tǒng)計學分析
　　 SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有結(jié)果均用x±s表示，采用單因素方差分析(one-way ANOVO)方法和t檢驗比較各組間的統(tǒng)計學差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 實驗結(jié)果：
　　 一、成功構(gòu)建短發(fā)夾的HMGB1基因的真核細胞表達載體
　　 構(gòu)建的質(zhì)粒pRNA-u6.1/Neo-H

12、MGB1-(1、2、3、NC)經(jīng)DNA測序鑒定證實HMGB1的shRNA表達載體構(gòu)建成功。
　　 二、在人的臍靜脈血管內(nèi)皮細胞中重組質(zhì)粒pRNA-u6.1/Neo-HMGB1有效的干擾HMGB1表達
　　 Western blot和Realtime-PCR結(jié)果顯示pRNA-u6.1/Neo-HMGB1-(1、2、3)均顯著干擾了HMGB1在人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞中的表達，pRNA-u6.1/ Neo-HMGB1-NC不具有

13、干擾作用(P＜0.05)。
　　 三、在人的臍靜脈血管內(nèi)皮細胞中重組質(zhì)粒pRNA-u6.1/Neo-HMGB1增加了HOXA9的表達
　　 Realtime-PCR結(jié)果顯示在人的臍靜脈血管內(nèi)皮細胞中抑制HMGB1的表達可以促進HOXA9的高表達(P＜0.05)。
　　 四、在人的臍靜脈血管內(nèi)皮細胞中重組質(zhì)粒pRNA-u6.1/Neo-HMGB1降低了E-選擇素的表達
　　 Realtime-PCR結(jié)果顯示

14、在人的臍靜脈血管內(nèi)皮細胞中抑制HMGB1的表達可以降低E-選擇素的表達(P＜0.05)。
　　 五、人工合成的干擾質(zhì)粒SiRNAHOXA9在人的臍靜脈血管內(nèi)皮細胞中有效的干擾的HOXA9的表達
　　 Western blot和Realtime-PCR結(jié)果顯示干擾質(zhì)粒SiRNAHOXA9顯著干擾了HOXA9在人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞中的表達，對照的SiRNAHOXA9不具有干擾作用(P＜0.05)。
　　 六、pRNA

15、-u6.1/Neo-HMGB1和SiRNAHOXA9共同在人的臍靜脈血管內(nèi)皮細胞中增加了E-選擇素的表達
　　 Realtime-PCR結(jié)果顯示，在人的臍靜脈血管內(nèi)皮細胞中抑制HMGB1的表達同時抑制HOXA9的表達可以增加E-選擇素的表達(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、成功構(gòu)建了人的HMGB1基因的短發(fā)夾的真核細胞表達載體并且在人的臍靜脈血管內(nèi)皮細胞中有效的干擾了HMGB1的表達。
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