模擬失重對人臍靜脈內(nèi)皮細胞iNOS表達的影響及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制研究.pdf

1、中長期載人航天飛行中的失重環(huán)境會對機體心血管系統(tǒng)產(chǎn)生不良影響，主要表現(xiàn)為運動耐力及立位耐力降低，嚴重影響航天員的健康及航天任務的完成。研究表明，失重后立位耐力不良的發(fā)生機理可能與失重后血容量減少、壓力反射敏感性降低、靜脈順應性下降及肌肉萎縮等因素有關(guān)，但其確切發(fā)生機制仍不清楚。目前認為，失重后立位耐力不良的發(fā)生涉及多重復雜機制，不論在人體實驗中，還是在動物實驗中，多家實驗室均發(fā)現(xiàn)血管系統(tǒng)的變化可能是導致心血管失調(diào)的重要因素。血管收縮功能

2、不良在失重后立位耐力降低的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要作用，但這種血管低反應性的確切機制仍待進一步闡明。
　　內(nèi)皮細胞廣泛分布于機體血管的內(nèi)表面，相互之間密切聯(lián)系而形成一層天然的物理屏障，從而維持著血管壁的完整性。由于其在血管壁中的特殊位置，故內(nèi)皮細胞可以對局部血管的血壓、氧分壓及血流變化迅速作出反應，通過合成和分泌多種血管活性物質(zhì)作用于血管平滑肌，從而調(diào)節(jié)血管的舒張和收縮。一氧化氮（NO）可由體內(nèi)多種組織細胞分泌，作為一種內(nèi)源性的細胞

3、內(nèi)信使分子在體內(nèi)多種生物學過程中擔當重要角色，尤其在心血管功能的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。機體的NO主要由一氧化氮合酶（NOS）催化L-精氨酸生成的，目前發(fā)現(xiàn)的NOS有三種同工酶：神經(jīng)元型（nNOS）、內(nèi)皮型（eNOS）和誘導型（iNOS）。nNOS和eNOS可在體內(nèi)持續(xù)表達，主要參與生理水平NO的調(diào)節(jié)；而iNOS在生理狀態(tài)下不表達，當誘導因素使其表達后，會持續(xù)釋放大量的NO，產(chǎn)生一系列生理及病理作用。有報道指出內(nèi)皮細胞對失重刺激具有高度敏感

4、性，表現(xiàn)為失重或模擬失重環(huán)境下，內(nèi)皮細胞可發(fā)生形態(tài)及基因表達的改變。大量的研究證明，尾吊模擬失重后大鼠機體NOS的活性增加。進一步研究發(fā)現(xiàn)，尾吊模擬失重可致大鼠股動脈等多種血管系統(tǒng)中出現(xiàn)iNOS的活性及表達量的增高，并且認為失重或模擬失重后內(nèi)皮細胞釋放的大量非生理濃度的NO是航天后機體血管收縮不良的重要原因。然而，失重或模擬失重導致的內(nèi)皮細胞iNOS表達變化及其調(diào)控機制尚未見報道。為了探討上述問題，我們以人臍靜脈內(nèi)皮細胞為研究對象，觀察

5、了回轉(zhuǎn)器模擬失重致HUVEC-CiNOS的表達變化，進而探討了其在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)機制。本研究主要結(jié)果與發(fā)現(xiàn)如下：
　　1.模擬失重對人臍靜脈內(nèi)皮細胞系HUVEC-CiNOS表達的影響本研究觀察了回轉(zhuǎn)器模擬失重24h對人臍靜脈內(nèi)皮細胞系HUVEC-CiNOS表達的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：地面靜止對照組與垂直旋轉(zhuǎn)對照組iNOSmRNA及蛋白表達均較低，而24h回轉(zhuǎn)器模擬失重后，HUVEC-CiNOSmRNA及蛋白表達量顯著增高，表明24h模擬

6、失重可致HUVEC-CiNOSmRNA和蛋白出現(xiàn)異常表達。轉(zhuǎn)染了含有7233bp的iNOS啟動子熒光素酶報告基因系統(tǒng)phiNOS(7.2)LucHUVEC-C在模擬失重24h后，熒光素酶相對活性約為1G對照組的2.29倍，表明回轉(zhuǎn)器模擬失重24h可致HUVEC-CiNOS在轉(zhuǎn)錄水平被激活。
　　2.模擬失重對HUVEC-CNF-κB及AP-1轉(zhuǎn)錄活性的影響本研究利用HUVEC-C轉(zhuǎn)染NF-κB及AP-1報告基因的方法，觀察了回轉(zhuǎn)器

7、模擬失重24h對HUVEC-C轉(zhuǎn)錄因子NF-κB及AP-1轉(zhuǎn)錄活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：回轉(zhuǎn)器模擬失重24h與1G對照組相比，模擬失重可顯著抑制NF-κB依賴的轉(zhuǎn)錄活性，抑制率為48％；以同樣的方法發(fā)現(xiàn)，回轉(zhuǎn)器模擬失重24h與1G對照組相比可顯著抑制AP-1依賴的轉(zhuǎn)錄活性，抑制率為38％。而兩組的陰性對照質(zhì)粒pCIS-CK轉(zhuǎn)染HUVEC-C后，回轉(zhuǎn)器模擬失重24h與地面1G對照組的熒光素酶相對活性相比無顯著差別，表明回轉(zhuǎn)器模擬失重24h可使

8、HUVEC-C中轉(zhuǎn)錄因子NF-κB及AP-1的轉(zhuǎn)錄活性顯著降低。
　　3.模擬失重致HUVEC-CiNOS異常表達機制的研究本研究通過改變轉(zhuǎn)錄因子NF-κB及AP-1的活性，觀察了模擬失重24h后HUVEC-CiNOS表達的變化，進而明確回轉(zhuǎn)器模擬失重24hHUVEC-CiNOS異常表達在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：應用50μMNF-κB阻斷劑PDTC后模擬失重24h，HUVEC-CiNOSmRNA、蛋白表達及轉(zhuǎn)染熒光素酶啟動子

9、報告基因的相對熒光量與單純模擬失重組相比未見顯著變化，提示NF-κB未參與模擬失重環(huán)境下HUVEC-CiNOS的異常表達調(diào)控。應用20μMAP-1特異阻斷劑SP600125后與單純模擬失重組相比，HUVEC-CiNOSmRNA、蛋白及轉(zhuǎn)染了phiNOS(7.2)Luc的相對熒光量均出現(xiàn)顯著升高，而過表達AP-1后，與單純模擬失重組相比HUVEC-CiNOSmRNA、蛋白表達及相對熒光活性均出現(xiàn)明顯抑制。以上結(jié)果提示，模擬失重24h所致的

10、HUVEC-CiNOS表達的增高部分地與轉(zhuǎn)錄因子AP-1的活性降低有關(guān)，而非NF-κB在起作用。
　　4.模擬失重致HUVEC-CiNOS異常表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)合區(qū)域研究本研究利用構(gòu)建的不同截短長度的iNOS啟動子熒光素酶報告基因系統(tǒng)，通過觀察回轉(zhuǎn)器模擬失重24h后轉(zhuǎn)染了各片段的HUVEC-C相對熒光量的變化，從而明確模擬失重24h致HUVEC-CiNOS異常表達的轉(zhuǎn)錄因子在iNOS啟動子上游結(jié)合作用區(qū)域。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)染了phiNO

11、S(0.6)Luc和phiNOS(1.0)LucHUVEC-C在模擬失重24h后，HUVEC-C細胞的熒光素酶活性與1G對照組相比無顯著差別，表明iNOS啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點上游1000bp內(nèi)無回轉(zhuǎn)器模擬失重24h誘發(fā)iNOS異常表達的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。
　　總之，本研究利用細胞回轉(zhuǎn)器模擬失重效應，觀察了模擬失重24h及1G重力環(huán)境下HUVEC-CiNOSmRNA、蛋白和啟動子激活水平的變化，進而探討了模擬失重致HUVEC-CiNO

12、S異常表達在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控機制。得出了如下結(jié)論：模擬失重24h可致HUVEC-CiNOSmRNA、蛋白異常表達及在轉(zhuǎn)錄水平被激活；模擬失重24h可降低HUVEC-C轉(zhuǎn)錄因子NF-κB及AP-1的轉(zhuǎn)錄活性；模擬失重24h導致的HUVEC-CiNOS異常表達與轉(zhuǎn)錄因子AP-1的轉(zhuǎn)錄活性降低有關(guān)，而與NF-κB的活性降低無關(guān)；iNOS啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點上游1000bp范圍內(nèi)無模擬失重24h誘發(fā)HUVEC-CiNOS異常表達的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。