降鈣素基因相關肽促進人臍靜脈血管內皮細胞增殖及其相關機制的初步研究.pdf

1、由于創(chuàng)傷、感染等各種原因造成的骨折、骨缺損、骨不愈合等一直是威脅人類生命健康的醫(yī)學難題。對于如何從根本上提高其治療效果，明確骨再生、重建、塑形的病理生理學特點及其相關生物學作用機制是其基礎和出發(fā)點。骨組織是一種伴隨著細胞外基質礦化、可以根據需要不斷進行自我修復的復雜動態(tài)組織，亦是帶有血管、神經支配的生物活性組織，因此，骨折修復的過程中既與人體內多種組織、細胞因子之間錯綜復雜的協(xié)同作用相關，也與骨組織的血液供應、神經支配緊密相關，因此重建

2、修復區(qū)域內環(huán)境生物學的穩(wěn)定性，尤其是重建血液供應和神經支配是關鍵步驟。血液供應的恢復對于保障骨組織及移植物生物學活性的重要性已經被許多基礎實驗及臨床實踐所證實，除此之外，神經因素可能在骨組織再生過程中同樣發(fā)揮著重要作用。
　　 骨骼是一種可根據需要不斷修復的生物活性組織，骨再生和骨重建是一個復雜的持續(xù)的動態(tài)過程，受體液和生物動力學等多種因素共同調節(jié)，尤其是與血液供應和神經支配密切相關。早已有學者們通過解剖學的研究發(fā)現骨組織中存在

3、著大量神經纖維，這些神經纖維多圍繞血管周圍并與之伴行，分布于骨膜、骨表明及骨髓等活躍區(qū)域。隨著研究的深入，已經證實，骨組織的神經纖維為肽能神經，可分泌多種神經肽參與調控多種生理功能，降鈣素基因相關肽(CGRP)是具有代表性的神經肽之一。降鈣素基因相關肽(calcilonin gene-relatedpeptide，CGRP)是一種含有37個氨基酸的生物活性多肽，由降鈣素基因組織特異性選擇性剪接所產生，廣泛分布于中樞系統(tǒng)、外周神經系統(tǒng)及某

4、些器官組織當中，參與和調節(jié)多種重要功能。CGRP是周圍神經中含量最多的一種神經肽，也是目前已知最強的內源性血管擴張肽，具有很強的血管擴張作用。研究證實CGRP在骨修復及重建過程中具有重要作用，降鈣素基因相關肽免疫反應神經纖維的出現與血管相關，并且和骨組織中的骨髓細胞，骨細胞和其它細胞均有相關性。這些神經纖維經常以串珠狀、類似靜脈曲張的外觀出現。CGRP免疫陽性神經纖維廣泛分布于骨膜、骨髓腔、干骺端等處。CGRP可能具有多種功能，可以作為

5、神經遞質，血管擴張劑和神經營養(yǎng)效應器發(fā)揮作用。CGRP可以促進血管內皮細胞增殖而促使血管形成，從而增加局部的血流。有研究表明，骨折患者的血漿中，CGRP濃度明顯增加，骨折局部CGRP陽性神經纖維數量也明顯增加。腦外傷患者骨折愈合速度較普通骨折患者快，且與血漿中高濃度CGRP相關。因此推測CGRP可能通過軸漿運輸到骨折局部，擴張局部血管，增加骨折局部的血液供應，從而促進骨折愈合。Aoki等學者的研究也證實，在大鼠脛骨骨折模型中，骨折愈合時

6、，骨膜、新生骨組織和纖維肉芽組織之中出現許多CGRP陽性神經纖維，且多數位于血管附近，這些感覺神經纖維可以在局部釋放出明顯高于血清水平的CGRP，參與骨折愈合過程。
　　 血管內皮細胞廣泛分布在血管內壁，是血管內壁的重要組成部分。研究發(fā)現骨組織具有高度血管化，在骨中，血管內皮位于骨髓的毛細血管腔壁內，與骨細胞、骨周圍神經都存在著緊密的聯系。血管化在骨修復和重建過程中發(fā)揮重要作用，血管形成是骨形成、再生、重塑的基礎，在骨再生過程中

7、，血管的形成要明顯早于骨的形成，血管可以向組織器官提供氧氣，輸送營養(yǎng)物質等，并可分泌多種生長因子，包括BMP、VEGF、OPG、IGF-1、bFGF、CO等，從而促進成骨細胞增殖及骨髓間充質干細胞向成骨細胞的分化，以促進成骨;同時抑制破骨細胞的活性，阻止其骨吸收作用;還可通過VEGF等直接作用于血管，影響新生血管的形成，進而調節(jié)骨的修復。血管生成能恢復骨折區(qū)域的血運，并能產生相關生長因子以調節(jié)成骨細胞活性，聚集干細胞、定向分化成骨細胞以

8、促進骨形成。而血管內皮細胞基膜的降解、增殖和遷移是新血管形成所必需的前提條件，成為骨修復的關鍵步驟。
　　 前期研究發(fā)現，CGRP可作為局部刺激因素刺激HUVECs增殖，CGRP對HUVECs的增殖作用具有時間-濃度依賴性。且在10-8 mol/L作用最強。本實驗在此基礎上，進行了更加深入的研究，不僅從正向進一步證實CGRP對HUVECs具有明顯的促增殖作用，而且還加入了CGRP拮抗劑CGRP8-37及MAPK通路相關蛋白拮抗劑

9、同時從反向驗證此效應，并從細胞信號轉導通路方面，對其具體作用機制進行了初步的探討。
　　 研究目的：
　　 進一步明確神經肽CGRP促進人臍靜脈血管內皮細胞(HUVECs)增殖的作用。
　　 從細胞信號轉導通路角度，初步探討神經肽CGRP在HUVECs促增殖作用中的生物學機制。
　　 第1部分人臍靜脈血管內皮細胞的獲取和鑒定
　　 目的:
　　 獲取人臍靜脈血管內皮細胞(HUVECs)，對

10、細胞表面特異性標記物(Ⅷ因子)進行免疫熒光鑒定，并用其作為種子細胞進行進一步相關研究。
　　 方法:
　　 獲取人臍靜脈血管內皮細胞
　　 新生兒剖宮產臍帶離體2h以內進行實驗，長度大約22 cm。以連接有50mL注射器的7號輸液針頭斜行插入臍靜脈內，然后以鑷子固定針頭，用含肝素的PBS液沖洗臍靜脈內血液，直至液體顏色清亮，將臍靜脈內多余的PBS液擠壓出。使用鉗子夾閉臍帶兩端，由針筒緩慢注入0.1％Ⅰ型膠原酶溶液

11、至靜脈充盈，置于37℃、5％CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中消化20 min。消化后用止血鉗擠壓揉搓臍帶外壁，使內皮細胞脫落。收集消化液，并以含肝素的PBS液沖洗臍靜脈2～3次;收集沖洗液，以離心半徑15 cm、800 r/min離心10 min后棄上清，加入EGM培養(yǎng)基，種植于1％明膠包被的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。48 h后全量換液，此后每3天換液1次，細胞融合達80％后消化傳代。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化。
　　 鑒定人臍靜脈血管內皮細胞

12、
　　 用第1代細胞行vWF免疫熒光鑒定。待細胞在蓋玻片上生長融合為單層后，4％多聚甲醛固定30 min，正常山羊血清封閉30 min;加入兔抗vWF抗體，置于濕盒中4℃過夜;加入DyLight594標記的山羊抗兔IgG，置于37℃中30 min;以5μg/mL DAPI染核10 min，緩沖甘油封片，倒置熒光相差顯微鏡下觀察。
　　 結果:
　　 體外成功分離培養(yǎng)出人臍靜脈血管內皮細胞(HUVECs)，經免疫熒

13、光鑒定符合血管內皮細胞特征。
　　 結論:
　　 膠原酶消化培養(yǎng)法可獲得大量人臍靜脈血管內皮細胞(HUVECs)，從而為下一步的研究提供了種子細胞。
　　 第2部分降鈣素基因相關肽人臍靜脈血管內皮細胞增殖的作用：
　　 目的:
　　 進一步探討降鈣素基因相關肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）對人臍靜脈血管內皮細胞（human umbilical vein

14、 endothelial cells，HUVECs）增殖的影響和作用。
　　 方法:
　　 AlarmarBlue法檢測各組HUVECs增殖
　　 將實驗組劃分為6組，分別是空白對照組、CGRP組、CGRP+CGRP8-37組、CGRP+PD98059組、CGRP+SB203580組、CGRP+SP600125組。利用AlarmarBlue法檢測各組人臍靜脈血管內皮細胞(HUVECs)的增殖變化情況。每組設3個復

15、孔，各組分別進行預處理，24h后每孔加入10μL AlamarBlue，37℃、5％ CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱靜置4h后，用多功能酶標儀設置激發(fā)波長530 nm和發(fā)射波長590 nm處測定熒光值，整個操作過程要避光進行。
　　 結果:
　　 與空白對照組相比，CGRP組能夠明顯促進HUVECs的增殖，而在經過CGRP拮抗劑CGRP8-37、ERK1/2拮抗劑PD98059、p-38拮抗劑SB203580、JNK拮抗劑SP6

16、00125預干預后的各實驗組中，CGRP誘導的HUVECs增殖效應可受到明顯的抑制。
　　 結論:
　　 CGRP能夠促進HUVECs的增殖，并且此效應可被ERK1/2、p-38、JNK拮抗劑所抑制，提示MAPK通路在此過程中起作用，CGRP的生物學機制可能通過MAPK通路發(fā)揮作用。
　　 第3部分降鈣素基因相關肽促進人臍靜脈血管內皮細胞增殖的生物學機制初步探討
　　 目的:
　　 初步探討降鈣素

17、基因相關肽(Calcitonin-gene-related peptide，CGRP)對人臍靜脈血管內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)促增殖作用的生物學作用機制。
　　 方法:
　　 將實驗組劃分為6組，分別是空白對照組、CGRP組、CGRP+CGRP8-37組、CGRP+PD98059組、CGRP+SB203580組、CGRP+SP600125組。免疫

18、印跡技術(Western blot)觀察CGRP誘導后ERK1/2、p-38、JNK的磷酸化表達變化情況，及CGRP8-37、PD98059、SB203580、SP600125預處理對ERK1/2、p-38、JNK磷酸化表達的影響。
　　 結果:
　　 CGRP可在一定范圍內呈時間依賴性地誘導HUVECs細胞ERK1/2、p-38、JNK的磷酸化，拮抗劑CGRP8-37、PD98059、SB203580和SP600125