TM4SF1基因?qū)θ四氺o脈血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)行為影響的初步研究.pdf

1、實體的惡性腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依靠腫瘤新生血管的形成，抗腫瘤血管生成藥物早已運(yùn)用到臨床治療方面?？缒に募易宄蓡T1(Transmembrane4super family, TM4SF1)是TM4SF家族(Tetraspanins)的一個遠(yuǎn)親，高表達(dá)于多種上皮性腫瘤中，在培養(yǎng)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）中也高表達(dá)。TM4SF1與腫瘤血管的生成密切相關(guān)，并被證實其高表達(dá)與多種腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后正相關(guān)。本課題組前期研究已從

2、用卵巢上皮癌患者腹水癌細(xì)胞構(gòu)建的cDNA表達(dá)文庫中，篩選出相關(guān)抗原TM4SF1，發(fā)現(xiàn)血清中的TM4SF1自身抗體可作為卵巢上皮癌診斷的血清學(xué)指標(biāo)，且下調(diào)TM4SF1的表達(dá)，可抑制卵巢上皮癌細(xì)胞株HO8910PM的增殖、遷移及轉(zhuǎn)移。本研究通過沉默TM4SF1基因在HUVEC的表達(dá)，研究TM4SF1對HUVEC增殖、遷移及血管生成的影響，并將沉默TM4SF1基因的人卵巢癌細(xì)胞HO8910PM與HUVEC共接種于裸鼠皮下，利用活體動物成像技術(shù)

3、，觀察沉默TM4SF1基因后對裸鼠皮下移植瘤的生長、轉(zhuǎn)移及腫瘤血管生成的影響。
　　本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 慢病毒介導(dǎo)TM4SF1基因沉默的HUVEC及HO8910PM穩(wěn)定株的構(gòu)建
　　目的：利用RNA干擾技術(shù)，建立慢病毒介導(dǎo)TM4SF1基因穩(wěn)定沉默的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）株及人卵巢癌細(xì)胞(HO8910PM)株。
　　方法：設(shè)計并合成含靶向沉默TM4SF1并同時表達(dá)GFP或熒光

4、素酶基因的兩種慢病毒載體，并命名為LV-TM4SF1-RNAi-GFP及LV-TM4SF1-RNAi-Luc，將LV-TM4SF1-RNAi-GFP感染高表達(dá)TM4SF1的HUVEC，經(jīng)流式細(xì)胞儀篩選出穩(wěn)定表達(dá)的GFP的細(xì)胞株LV-TM4SF1-RNAi-GFP/HUVEC。將LV-TM4SF1-RNAi-Luc感染高表達(dá)TM4SF1的HO8910PM，用嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶基因的LV-TM4SF1-RNAi-Luc/HO89

5、10PM。以陰性對照及空白對照為對照，通過RT-PCR及Westem blotting技術(shù)檢測兩種穩(wěn)定株中TM4SF1的基因及蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建了靶向沉默TM4SF1并同時表達(dá)GFP或熒光素酶基因的兩種慢病毒載體，感染并篩選出穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株LV-TM4SF1-RNAi-GFP/HUVEC及LV-TM4 SF1-RNAi-Luc/HO8910PM，與陰性對照LV-CON-RNAi-GFP/HUVEC(LV-CON-RNA

6、i--Luc/HO8910PM)組及HUVEC(HO8910PM)空白組相比，LV-TM4SF1-RNAi-GFP/HUVEC及LV-TM4SF1-RNAi-Luc/HO8910PM組TM4SF1 mRNA表達(dá)顯著下降，為[(0.06±0.02) vs(0.95±0.13)/(1.02±0.13),P＜0.05]([(0.05±0.02) vs(0.91±0.13)/(1.04±0.13),P＜0.05]);蛋白表達(dá)亦明顯降低[(0.1

7、3±0.01)vs(0.75±0.03)/(0.75±0.04),P＜0.05](0.11±0.01)vs(0.58±0.02)/(0.65±0.03),P＜0.05])，而陰性對照LV-CON-RNAi-GFP/HUVEC(LV-CON-RNAi--Luc/HO8910PM)組及HUVEC(HO8910PM)空白組差別無統(tǒng)計學(xué)意義，P均大于0.05。
　　結(jié)論：利用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建出穩(wěn)定沉默TM4SF1的LV-TM4SF1-R

8、NAi-GFP/HUVEC及LV-TM4 SF1-RNAi-Luc/HO8910PM細(xì)胞株。
　　第二部分 TM4SF1基因沉默對血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)行為影響的體外研究
　　目的：探討TM4SF1基因沉默對HUVEC的增殖、周期、遷移及血管生成的影響。
　　方法：實驗分3組:HUVEC空白組，LV-CON-RNAi--Luc/HO8910PM組及LV-TM4SF1-RNAi-GFP/HUVEC組。應(yīng)用CCK-8法檢測細(xì)胞

9、增殖能力的變化，F(xiàn)CM檢測細(xì)胞周期的變化，Transwell小室檢測細(xì)胞遷移能力的改變，基質(zhì)膠成管實驗檢測細(xì)胞血管生成能力的改變。
　　結(jié)果：TM4SF1基因沉默后，HUVEC增殖活性受抑制[72h時OD值:(0.59±0.06) vs(0.98±0.04)/(1.05±0.05)，P＜0.05];細(xì)胞被阻滯在G0/G1期[(69.30±5.48) vs(54.44±4.09)/(51.69±4.16)，P＜0.05];遷移能力明

10、顯降低[(14.20±4.59) vs(70.60±17.75)/(74.40±16.06)，P＜0.05];管腔樣結(jié)構(gòu)明顯減少[(3.33±1.52) vs(19.66±1.52)/(22.66±2.08)，P＜0.05]。而HUVEC空白組與LV-CON-RNAi--Luc/HO8910PM組差別無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：沉默TM4SF1基因使HUVEC的增殖、遷移及血管生成能力均受抑制。
　　第三部分 TM4SF1基因

11、沉默對卵巢癌腫瘤血管形成影響的體內(nèi)研究
　　目的：構(gòu)建適用于小動物活體成像系統(tǒng)觀察的裸鼠皮下移植瘤模型，探討TM4SF1基因沉默對卵巢癌腫瘤生長、轉(zhuǎn)移及血管生成的影響。
　　方法：用transwell小室共培養(yǎng)HO8910PM及HUVEC細(xì)胞，確定兩種細(xì)胞體外最適合生長比例。再按已確定的細(xì)胞比例將穩(wěn)定沉默TM4SF1的HUVEC及HO8910PM細(xì)胞株共接種于裸鼠皮下，構(gòu)建適用于小動物活體成像系統(tǒng)觀察的裸鼠皮下移植瘤模型。將

12、36只雌性裸鼠隨機(jī)分為6組，分別為A: LV-CON-RNAi-Luc/HO8910PM; B: LV-TM4SF1-RNAi-Luc/ HO8910PM; C: LV-CON-RNAi-Luc/HO8910PM+LV-CON1-RNAi-GFP/ HUVEC; D: LV-CON-RNAi-Luc/HO8910PM+LV-TM4SF1-RNAi-GFP/HUVEC,E:LV-TM4SF1-RNAi-Luc/HO8910PM+LV-CO

13、N1-RNAi-GFP/HUVEC;F:LV-TM4SF1-RNAi-Luc/HO8910PM+LV-TM4SF1-RNAi-GFP/HUVEC。通過活體成像系統(tǒng)檢測腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移，通過免疫組化染色技術(shù)觀察各組移植瘤中腫瘤血管形成的情況。
　　結(jié)果：transwell小室共培養(yǎng)HO8910PM及HUVEC細(xì)胞，確定兩種細(xì)胞體外最適合生長比例為HO8910PM/HUVEC:2/1?；铙w成像系統(tǒng)能夠檢測體外最小的生物素發(fā)光的腫瘤細(xì)胞

14、數(shù)為102個。36只裸鼠成瘤率100％，6周時共死亡4只。到第6周時，共接種HUVEC組(C、D、E、F)移植瘤體積明顯大于單接種HO8910PM組(A、B)。B組移植瘤體積明顯小于陰性對照組A[(0.11±0.05) vs(0.87±0.05)，P＜0.05];D、E、F組移植瘤體積也不同程度的小于陰性對照組C[(0.26±0.06)/(0.23±0.07)/(0.04±0.03)vs(0.72±0.08)，P均＜0.05]，共接種組

15、中完全沉默組F移植瘤最小，部分沉默組D與E相當(dāng)。活體成像系統(tǒng)下觀察移植瘤的動態(tài)生長情況，隨著時間的延長，生物發(fā)光熒光信號逐漸增強(qiáng)，但6組均未檢測到轉(zhuǎn)移瘤，解剖裸鼠未見腹腔各臟器種植及轉(zhuǎn)移瘤。采用RT-PCR及Western blotting方法驗證移植瘤TM4SF1的基因和蛋白沉默效果，沉默組明顯低于對照組，與體外細(xì)胞實驗一致。免疫組化染色技術(shù)觀察得出，共接種HO8910PM和HUVEC組(C、D、E、F)的微血管數(shù)明顯高于單接種HO8

16、910PM組(A、B)，但僅在共接種組中見到人源化的微血管。單接種組中，對照組（6.67±1.53）與沉默組（6.33±0.57）微血管數(shù)差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。共接種組中人源化微血管數(shù)占總微血管數(shù)90％以上。從總微血管數(shù)來看，C組（60.67±5.77）和E組（60.33±9.07）微血管數(shù)明顯多于D組（36.35±6.42）和F組（31.56±6.11）（P均＜0.05），而C組和E組、D組和F組之間微血管數(shù)無明顯差異（P