mICAM-1在MSCs和EPCs間黏附作用的研究.pdf

1、目的：
　　探討細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1）在間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）和血管內(nèi)皮前體細(xì)胞（EPCs）間黏附作用及其機(jī)制的研究。
　　方法：
　　1.分離、培養(yǎng)及擴(kuò)增來源于6-8周齡的C57BL/6小鼠骨髓的MSCs和EPCs；
　　2.Elisa方法檢測MSCs，EPCs，MSCs&EPCs，EPCs-CM-MSCs和MSCs-CM-EPCs條件培養(yǎng)基（-CM）中IL-1β的表達(dá)水平；
　　3.細(xì)胞免疫

2、熒光檢測ICAM-1在正常組、IL-1β刺激組、P38MAPK通路抑制劑SB203580刺激組中MSCs組、EPCs組、MSCs+EPCs共培養(yǎng)組（MSC&EPC）ICAM-1的表達(dá)情況；
　　4.通過Western blot技術(shù)檢測 ICAM-1在正常組、IL-1β刺激組、P38MAPK通路抑制劑SB203580組中ICAM-1蛋白和P38MAPK通路蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測；
　　5.通過添加相應(yīng)濃度抗ICAM-1中和抗體

3、、IL-1β、SB203580，在基質(zhì)膠上觀察MSCs和EPCs間黏附的變化。
　　結(jié)果：
　　1.通過Elisa方法檢測MSCs，EPCs，MSCs&EPCs，EPCs-CM-MSCs和MSCs-CM-EPCs中IL-1β的表達(dá)水平。所有的細(xì)胞均以同樣的密度種植，且使用無血清、無生長因子的無菌PBS培養(yǎng)，誘導(dǎo)時間均為24 h。結(jié)果顯示，MSCs組（8.96±2.70 ng/ml,*P<0.05）和EPCs組（22.14±1

4、.83 ng/ml,*P<0.05）均可分泌IL-1β，但MSCs&EPCs組（49.13±6.21 ng/ml）分泌量明顯高于MSCs組和EPCs組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。EPCs-CM-MSCs組（35.02±1.19 ng/ml）和MSCs-CM-EPCs組（33.85±1.37 ng/ml）IL-1β的分泌量明顯高于MSCs組（8.96±2.70 ng/ml,*P<0.05）和EPCs組（22.14±1.83 ng/ml,*P<0.

5、05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但并不高于MSCs&EPCs組（49.13±6.21 ng/ml,P>0.05）。
　　2.通過細(xì)胞免疫熒光檢測IL-1β誘導(dǎo)組、正常組及P38MAPK通路抑制劑組ICAM-1的表達(dá)水平。每個細(xì)胞玻片以相同的細(xì)胞密度于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24h。然后使用無血清及生長因子的培養(yǎng)基替代，加入IL-1β（25μg/ml）及P38MAPK通路抑制劑SB203580（20μmol/ml）誘導(dǎo)24 h，正常組不

6、添加任何藥物處理。結(jié)果顯示MSCs和EPCs均低表達(dá) ICAM-1，且 MSCs&EPCs促進(jìn) ICAM-1的表達(dá)。IL-1β促進(jìn)MSCs、EPCs及MSCs&EPCs ICAM-1的表達(dá)，P38MAPK通路抑制劑SB203580下調(diào)MSCs、EPCs及MSCs&EPCs ICAM-1的表達(dá)。IL-1β誘導(dǎo)組ICAM-1表達(dá)高于正常組和P38MAPK通路抑制劑SB203580誘導(dǎo)組的相應(yīng)各組，且P38MAPK通路抑制劑SB203580誘

7、導(dǎo)組的相應(yīng)各組ICAM-1表達(dá)較正常組下調(diào)。
　　3.通過Western blot檢測ICAM-1及 P38MAPK蛋白的表達(dá)水平。MSCs，EPCs和MSCs&EPCs組均表達(dá)ICAM-1和P38MAPK通路蛋白，結(jié)果以ICAM-1/GAPDH IOD平均水平和p-P38MAPK/total-P38MAPK IOD平均水平表示。結(jié)果顯示正常組MSCs&EPCs組（0.21±0.01,*P<0.05）ICAM-1蛋白的表達(dá)量較正常

8、組MSCs組（0.11±0.02,*P<0.05）和EPCs組（0.11±0.02,*P<0.05）高。IL-1β誘導(dǎo)組MSCs&EPCs組（0.38±0.02,*P<0.05）ICAM-1蛋白的表達(dá)量較同組內(nèi)MSCs組（0.23±0.02,*P<0.05）和EPCs組（0.25±0.02,*P<0.05）高。P38MAPK通路抑制劑SB203580誘導(dǎo)組MSCs&EPCs組（0.10±0.02,*P<0.05）ICAM-1蛋白的表達(dá)量

9、較同組內(nèi)MSCs組（0.05±0.01,*P<0.05）和EPCs組（0.05±0.01,*P<0.05）高。IL-1β誘導(dǎo)組的MSCs組、EPCs組及MSCs&EPCs組ICAM-1蛋白的表達(dá)量均高于相應(yīng)的正常組和P38MAPK通路抑制劑SB203580誘導(dǎo)組。正常組的MSCs組、EPCs組及MSCs&EPCs組ICAM-1蛋白的表達(dá)量均高于相應(yīng)的P38MAPK通路抑制劑SB203580誘導(dǎo)組。正常組MSCs&EPCs組（0.52±0

10、.02,*P<0.05）p-P38MAPK通路蛋白的表達(dá)量較正常組MSCs組（0.35±0.02,*P<0.05）和EPCs組（0.36±0.01,*P<0.05）高。IL-1β誘導(dǎo)組MSCs&EPCs組（0.74±0.06,*P<0.05）p-P38MAPK通路蛋白的表達(dá)量較同組內(nèi)MSCs組（0.54±0.04,*P<0.05）和EPCs組（0.47±0.03,*P<0.05）高。P38MAPK通路抑制劑 SB203580誘導(dǎo)組MSC

11、s&EPCs組（0.37±0.02,*P<0.05）p-P38MAPK通路蛋白的表達(dá)量較同組內(nèi)MSCs組（0.26±0.03,*P<0.05）和EPCs組（0.17±0.01,*P<0.05）高。IL-1β誘導(dǎo)組的 MSCs組、EPCs組及 MSCs&EPCs組p-P38MAPK通路蛋白表達(dá)量均高于正常組和P38MAPK通路抑制劑SB203580誘導(dǎo)組。正常組的MSCs組、EPCs組及MSCs&EPCs組p-P38MAPK通路蛋白表達(dá)量

12、均高于相應(yīng)的P38MAPK通路抑制劑SB203580誘導(dǎo)組。各組total-P38MAPK通路蛋白表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異。
　　4.MSCs和EPCs間的黏附實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中我們以DAPI標(biāo)記MSCs，以Mitotracker red標(biāo)記EPCs。將標(biāo)記后的MSCs和EPCs細(xì)胞在鋪有基質(zhì)膠的24孔板上進(jìn)行共培養(yǎng)，同時依次添加抗ICAM-1中和抗體、IL-1β和P38MAPK通路抑制劑SB203580，正常組不做處理。結(jié)果顯示加入抗IC

13、AM-1中和抗體和P38MAPK通路抑制劑SB203580組中MSCs和EPCs的黏附較正常組降低，而添加IL-1β誘導(dǎo)組MSCs和EPCs的黏附較正常組增多。
　　結(jié)論：
　　1.利用全骨髓貼壁法結(jié)合差時貼壁法可有效分離和擴(kuò)增MSCs和EPCs細(xì)胞。
　　2.ICAM-1參與介導(dǎo)MSCs和EPCs間的黏附過程。
　　3.IL-1β促進(jìn)ICAM-1的表達(dá)增高以增強(qiáng)MSCs和EPCs間的黏附通過P38MAPK通路；