CD73-腺苷信號在MSCs治療EAU中的作用及機制研究.pdf

1、目的：
　　本實驗通過探索建立小鼠EAU動物模型，對比研究MSCs及阻斷CD73功能的MSCs對EAU的治療效果，觀察臨床、病理表現(xiàn)及視網(wǎng)膜功能改變，明確CD73在MSCs免疫調(diào)節(jié)過程中的重要作用。另外，檢測小鼠脾臟及頸部引流淋巴結(jié)中T淋巴細胞增殖能力及分化情況，并分析MSCs對T淋巴細胞表面CD73表達的影響，以闡明MSCs通過CD73/腺苷信號對EAU進行免疫調(diào)節(jié)的作用機制。最終進一步完善MSCs的免疫調(diào)節(jié)機制網(wǎng)絡，為臨床應用

2、MSCs治療葡萄膜炎等自身免疫性疾病提供新的方法和理論基礎。
　　方法：
　　1.MSCs培養(yǎng)：C57BL/6小鼠脂肪來源MSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定，人脂肪來源MSCs的分離、培養(yǎng)。
　　2.建立EAU動物模型：過繼轉(zhuǎn)移IRBP1-20抗原特異性T淋巴細胞至C57BL/6小鼠建立過繼轉(zhuǎn)移EAU動物模型。
　　3.MSCs預處理：在MSCs體外培養(yǎng)體系中加入CD73競爭性抑制劑APCP，過夜，待用。
　　4.

3、MSCs治療：過繼免疫后第10天，PBS對照組、MSCs治療組及經(jīng)APCP預處理的MSCs治療組分別行單次尾靜脈注射1ml無菌PBS、MSCs單細胞懸液或經(jīng)APCP預處理的MSCs單細胞懸液。
　　5.臨床觀察：過繼免疫后第8天至60天，隔日觀察EAU小鼠眼底發(fā)病情況，并根據(jù)Caspi臨床分級評分。
　　6.組織病理學觀察：過繼免疫后第60天，處死各組小鼠，制備視網(wǎng)膜組織切片，行組織病理學觀察，并根據(jù)Caspi病理分級評分。

4、
　　7.視網(wǎng)膜功能檢測：過繼免疫后第25、35、45、60天分別對各組小鼠進行ERG檢測，評價視網(wǎng)膜功能。
　　8.5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine，Brdu）測定T細胞增殖：過繼轉(zhuǎn)移后第21天，取各組EAU小鼠脾臟和引流淋巴結(jié)T細胞，在0、1、10、30μg/ml IRBP1-20抗原刺激下培養(yǎng)，Brdu法檢測體內(nèi)T細胞增殖指數(shù)。另外，取過繼轉(zhuǎn)移后第21天模型對照組EAU小鼠脾臟和引流淋

5、巴結(jié)細胞，將MSCs或經(jīng)APCP預處理的MSCs與T淋巴細胞按1:5、1:10、1:20混合培養(yǎng)，在CD39抑制劑POM-1、CD73抑制劑APCP或A2A腺苷受體拮抗劑SCH58261干預下，Brdu法檢測體外T細胞增殖指數(shù)。
　　9.T細胞分化檢測：過繼轉(zhuǎn)移后第21天，取模型對照組EAU小鼠脾臟和引流淋巴結(jié)T細胞，與MSCs或經(jīng)APCP預處理的MSCs混合培養(yǎng)，應用流式細胞儀分析CD4+IL-17+細胞及CD4+Foxp3+細

6、胞比例。
　　結(jié)論：
　　10.MSCs表面CD73功能檢測：應用孔雀綠比色實驗及高效液相色譜法檢測CD73的核苷酸外切酶功能及MSCs培養(yǎng)上清中腺苷的生成量。
　　11. T細胞表面CD73表達變化檢測：過繼轉(zhuǎn)移后第21天，取模型對照組EAU小鼠脾臟和引流淋巴結(jié)T淋巴細胞，與MSCs共培養(yǎng)或在MSCs分泌的各種細胞因子干預下混合培養(yǎng)，流式細胞儀檢測各組活化的CD4+T淋巴細胞表面CD73的表達差異。
　　結(jié)果：

7、
　　1.成功分離培養(yǎng)小鼠脂肪來源MSCs及人脂肪來源MSCs，并鑒定。
　　2.成功建立小鼠過繼免疫EAU模型。
　　3.臨床觀察顯示，MSCs治療組臨床評分較空白對照組顯著降低（P<0.05），而經(jīng)APCP預處理的MSCs治療組臨床評分顯著高于MSCs治療組（P<0.05）。
　　4.組織病理學觀察顯示，MSCs療法顯著減輕視網(wǎng)膜組織損傷（P<0.05）。經(jīng)APCP預處理的MSCs對于視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的保護作用大大

8、減弱（P<0.05）。
　　5.視網(wǎng)膜功能檢測顯示，MSCs療法對EAU小鼠的視網(wǎng)膜功能具有顯著的保護作用（P<0.05），而經(jīng)APCP預處理的MSCs對視網(wǎng)膜功能的保護作用大大降低（P<0.05）。
　　6.T細胞增殖實驗顯示，MSCs可顯著抑制IRBP1-20抗原特異性 T細胞增殖（P<0.05）。而經(jīng)APCP預處理的MSCs對T細胞的增殖抑制能力大幅減弱（P<0.05）。當CD39/CD73/腺苷通路上任何環(huán)節(jié)被阻斷，

9、T細胞均可呈現(xiàn)顯著增殖。
　　7. T細胞分化實驗顯示，MSCs共培養(yǎng)可明顯提高CD4+T細胞中Foxp3+T細胞相對于IL-17+T細胞的比例（P<0.05）。
　　8.孔雀綠比色實驗及高效液相色譜法檢測顯示，MSCs表面CD73具有核苷酸外切酶的功能，可將AMP降解為腺苷，APCP可顯著抑制其功能（P<0.05）。
　　9. T細胞表面CD73表達差異檢測顯示，MSCs共培養(yǎng)可上調(diào)活化T細胞表面CD73的表達水平（