葛根素水凝膠在MSCs移植治療心肌梗死中的作用及機制研究.pdf

1、干細胞移植治療心肌梗死是最有希望使心肌再生的方法，是近十余年來該研究領(lǐng)域的熱點，未來發(fā)展的主要方向之一。骨髓間充質(zhì)干細胞(Mesenchymalstem cells，MSCs)由于其獲取和擴增方便，有多向分化能力，可以自體移植及異體移植有免疫豁免功能等優(yōu)點而倍受青睞，是近年來用于臨床研究最常見的干細胞之一。但是，臨床試驗結(jié)果表明，干細胞移植治療后遠期獲益不明顯，全因死亡率等主要臨床終點改善不佳。究其原因主要是干細胞移植后面臨心肌局部血流

2、的沖擊和細胞壞死后產(chǎn)生的過氧化物損傷，導致干細胞的滯留率和存活率都很低。如能為移植的干細胞提供一個暫時的“安身的場所”，并對干細胞的功能進行調(diào)控，增強其抵抗心梗局部過氧化微環(huán)境損傷，則有希望提高干細胞的存活和滯留，從而發(fā)揮其應(yīng)有的作用。
　　可注射性心肌組織工程(Injectable cardiac tissue engineering)是將可注射性支架材料通過心內(nèi)膜或心外膜局部注射到心肌病變位置進行治療。一般是指具有三維網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)

3、構(gòu)的水凝膠，具有一定的韌性和粘稠度，富含水分達95％以上，可以攜帶藥物或者細胞進行治療。研究表明，水凝膠可以作為細胞移植的載體，能夠粘附包裹移植細胞，在一定程度上減少因為滲漏或者血流沖擊造成的細胞流失，增加細胞在目標位點的滯留時間和數(shù)量而發(fā)揮其應(yīng)有的作用;另外，用可注射性水凝膠進行心肌組織工程治療可以增加室壁厚度，為心室壁提供一個機械支撐力，從而減少心室張力，改善心室重構(gòu)，改善心功能，當水凝膠的機械力學性質(zhì)類似于健康心肌，這個效果更顯著

4、。
　　冠脈梗塞后由于局部心肌缺血缺氧，或者由于血管重建再通導致的再灌注損傷，心肌細胞及成纖維細胞等在代謝過程中可以產(chǎn)生一系列活性氧簇(Reactive oxygenspecies，ROS)，主要包括:O2-、H2O2、HO2·和·OH等，對心肌細胞和外源性移植的干細胞都可以造成嚴重損傷。如能開發(fā)出具有抗氧化作用的水凝膠，不僅能發(fā)揮水凝膠的機械支撐作用，而且可以有效降低梗死區(qū)局部ROS水平，保護細胞免受損傷，提高細胞移植后的存活率

5、。
　　葛根素(化學名為8-β-D-葡萄糖吡喃糖-7，4'-二羥基異黃酮，puerarin)是從野葛的干燥根中提取分離得到的主要活性成分，是一種異黃酮類化合物。研究顯示:葛根素能夠清除超氧化物陰離子，抑制由過氧化氫引起的紅細胞溶血損傷和脂質(zhì)過氧化物的生成;能保護過氧化誘導的內(nèi)皮細胞和PC12細胞損傷，有很好的保護細胞，抗過氧化的作用;基礎(chǔ)實驗研究表明葛根素這種保護細胞與抗凋亡的作用的可能機制為:(1)葛根素分子可以提供質(zhì)子耦合機體

6、過量的ROS，直接破壞H2O2分子，降低細胞內(nèi)的過氧化水平，從而減少其對細胞的損傷;(2)提高MSCs的內(nèi)源性抗氧化酶，比如SOD酶、GSH-PX等酶的活性，提高細胞自身抗氧化防御系統(tǒng)對過氧化陰離子的清除能力;(3)葛根素能直接參與損傷細胞DNA的修復(fù)。因此，面對細胞移植后心梗局部的過氧化微環(huán)境損傷，葛根素有望能夠調(diào)控干細胞移植后的存活。
　　如能開發(fā)出葛根素類水凝膠進行心肌組織工程治療，不僅能夠為梗塞后心室提供機械支撐力，包載移

7、植細胞減少細胞的流失，而且可以發(fā)揮葛根素抗氧化保護細胞的作用，進一步增加移植細胞的滯留和存活，使其發(fā)揮最大功效。
　　載藥水凝膠的構(gòu)建一般包括化學鍵鍵合和物理包裹的形式，在前者中藥物既成為藥物釋放的對象又是載體的一部分，能夠明顯提高藥物包載率，但是較后者在材料的選擇和制作工藝上有更高的要求。我們課題組在嘗試采用葛根素鍵合多肽構(gòu)建水凝膠的過程中發(fā)現(xiàn)，葛根素本身不進行任何的化學修飾就能夠通過簡易的工藝和促發(fā)方式自組裝形成水凝膠。結(jié)合葛

8、根素的化學結(jié)構(gòu)及其他成膠體系的成膠原理，我們推測葛根素水凝膠(Puerarin hydrogel，PG)的成膠原理可能為:葛根素分子結(jié)構(gòu)中既含有親水的葡萄吡喃糖結(jié)構(gòu)也有相對疏水的異黃酮結(jié)構(gòu)，在常溫下處于微溶物質(zhì)，在加熱下可以使其完全溶解，冷卻時可以通過分子間苯環(huán)堆疊力、疏水作用力和氫鍵作用自組裝形成具有三維纖維網(wǎng)絡(luò)的膠體結(jié)構(gòu)。葛根素水凝膠是迄今為止發(fā)現(xiàn)的第一種能自己形成小分子水凝膠的天然藥物。葛根素水凝膠的發(fā)現(xiàn)具有明顯的優(yōu)勢:(1)由于

9、成份只有葛根素本身，因此其藥物包載率是100％，是藥物包載率最高的藥物載體，其藥物釋放是通過膠體的緩慢降解實現(xiàn);(2)制作工藝和成膠方式簡便;(3)通過加熱冷卻后約數(shù)分鐘成膠，為其可注射性創(chuàng)造條件。接著，課題組對葛根素水凝膠進行研究，主要包括水凝膠的物理化學性能表征和生物學相容性檢測，體外觀察葛根素水凝膠在過氧化環(huán)境下保護MSCs的能力，葛根素水凝膠攜帶MSCs體內(nèi)移植大鼠心肌梗死模型的研究。研究分以下三部分進行:
　　第一部分:

10、葛根素水凝膠的物理化學性能表征和生物學相容性檢測
　　我們對葛根素水凝膠表征時觀察到，其最低成膠濃度為1％，并且為均勻的透明頭膠體，隨著膠體濃度增高，其透明性有所減弱，6％時形成乳白色的不透明的水凝膠;通過透射電鏡表征水凝膠的自組裝形貌:葛根素水凝膠為三維網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，各個濃度的水凝膠均形成較長的納米纖維，纖維直徑大約為10-50nm，1％、2％和4％形成的纖維長度及直徑均相似;力學性能表征發(fā)現(xiàn)，葛根素水凝膠是非頻率依賴性，而是應(yīng)力

11、依賴型膠體，2％和4％的葛根素水凝膠處于穩(wěn)定狀態(tài)時的力學強度約為10KPa，這與心肌組織的力學強度相似，適合進行心肌組織工程研究;體外藥物釋放實驗發(fā)現(xiàn):在生理環(huán)境下，2％和4％濃度的水凝膠在前12h以較快的速率釋放葛根素藥物，藥物可以持續(xù)釋放12h以上;細胞相容性實驗表明:CCK-8檢測結(jié)果顯示葛根素水凝膠與心肌細胞和心肌成纖維細胞均有良好的細胞相容性，無明顯細胞毒害作用;
　　第二部分:葛根素水凝膠在過氧化環(huán)境下保護MSCs的能

12、力研究及機制探討
　　本實驗采用100μmol/L H2O2干預(yù)1h作為外源性ROS模擬體內(nèi)心肌梗死后的過氧化環(huán)境。實驗分5組進行:正常MSCs組、H2O2干預(yù)組、H2O2+2％PG組、H2O2+4％PG組和H2O2+6％PG組。通過檢測細胞內(nèi)的SOD活性、MDA含量和ROS熒光探針DHE的水平可以反映細胞內(nèi)ROS的含量，與正常MSCs組比較，H2O2干預(yù)組細胞內(nèi)MDA含量和SOD活性增加，DHE紅色熒光數(shù)量明顯增加，而2％、4％

13、和6％濃度的葛根素水凝膠可以顯著減少SOD活性和MDA含量，DHE紅色熒光明顯減少;用CCK-8檢測細胞存活和增殖，培養(yǎng)基中LDH的釋放反映細胞毒性的大小，AO/EB染色從細胞形態(tài)學上觀察細胞的存活和凋亡，AnnexinV-FITC/PI雙染凋亡檢測法檢測細胞的凋亡率，這些檢測結(jié)果表明H2O2誘導后細胞存活減少、死亡增加，2％、4％和6％的葛根素水凝膠均可明顯降低氧化應(yīng)激后MSCs的凋亡率，增加細胞存活;Western blot分析顯示

14、2％、4％和6％的葛根素水凝膠可使抑制細胞凋亡蛋白Bcl-2表達增加和促凋亡蛋白Bax和Caspase-3表達減少，從蛋白水平印證了細胞形態(tài)學的變化。這些結(jié)果均表明H2O2誘導細胞ROS的產(chǎn)生及細胞存活減少、凋亡增多，而通過2％、4％和6％的葛根素水凝膠培養(yǎng)細胞均可以抑制ROS的產(chǎn)生，保護細胞減少細胞凋亡，其機制可能是通過減少促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表達和增加抑制細胞凋亡蛋白Bcl-2的表達產(chǎn)生作用。
　　第三部分:

15、葛根素水凝膠在MSCs移植治療大鼠心肌梗死中的作用及機制研究
　　在本部分研究中，我們將可注射性葛根素水凝膠攜帶MSCs移植治療大鼠心肌梗死模型，以觀察其對移植細胞的滯留存活、大鼠心功能和心臟結(jié)構(gòu)的改善作用。實驗采用心臟超聲對移植后心功能的變化進行評價;HE染色、Masson染色檢測移植后心臟組織的形態(tài)學變化，包括室壁厚度，心梗面積和心肌纖維化程度;用免疫熒光評價心梗部位心肌和血管新生情況，Western blot檢測抗凋亡蛋白和

16、促凋亡蛋白的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn):細胞移植后4周，4％PG+MSCs組較單純MSCs組的細胞滯留及存活明顯增加;移植治療術(shù)后4周，心彩超心功能檢測提示4％PG+MSCs組、MSCs組和4％PG水凝膠聯(lián)合MSCs組均能改善左室射血分數(shù)(LVEF)，增加心室短軸縮短率(FS)，但4％PG+MSCs組改善更加明顯;組織形態(tài)學檢測顯示4％PG、MSCs組和4％PG+MSCs組均能改善心梗后室壁厚度，減少心梗面積，減少心肌纖維化程度，減少心肌損傷，增加

17、血管新生，增加心肌組織數(shù)量，且葛根素水凝膠聯(lián)合MSCs治療組的效果更加明顯。
　　綜述所述，本研究成功制備葛根素水凝膠，其成份只有葛根素，是現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的第一種能自組裝形成水凝膠的天然藥物，其具有與心肌組織相近的力學強度，能夠平穩(wěn)釋放葛根素藥物達12小時以上，具有良好的心肌細胞和心肌成纖維細胞相容性;葛根素是一種強抗氧化劑，可以減少H2O2誘導的細胞ROS水平，增加細胞存活，減少細胞凋亡率及細胞凋亡相關(guān)蛋白的產(chǎn)生，其機制可能與其抑制凋

18、亡有關(guān);葛根素水凝膠能夠提高移植細胞在心梗局部的滯留和存活，促進MSCs改善心功能和心室重構(gòu)的治療效果，其機制可能是通過抗氧化，減少細胞凋亡，促進血管新生，改善心梗微環(huán)境的作用修復(fù)心梗組織。本研究從干細胞移植治療的不足這一關(guān)鍵臨床問題出發(fā)，緊密結(jié)合生物材料學與心肌組織工程學，研制了葛根素水凝膠并對其抗過氧化、保護細胞的生物學效用進行研究，并包裹干細胞移植治療動物心梗模型，闡明其改善心梗微環(huán)境與促進心梗修復(fù)的作用及可能機制，對于心肌組織工