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文檔簡介
1、實驗背景:
心肌梗死(myocardial infarction,MI)是常見的致死性疾病之一,即使患者度過急性期,也可能會由于成體心肌細胞的再生能力不足,使心肌細胞發(fā)生不可逆的丟失,進一步壞死心肌組織會被纖維瘢痕組織替代,最終導致心力衰竭的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn),應用骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)移植技術治療MI能夠有效防止病理性心室重構(gòu),增強心臟收縮功能,促進心功能恢復。BM
2、SCs移植到梗死心肌邊緣區(qū)后,可通過旁分泌多種生長因子誘導血管新生,從而改善梗死區(qū)微環(huán)境進而發(fā)揮功效。因此,通過人工干預手段提高BMSCs移植后的促血管新生因子旁分泌的作用,始終是心血管病學、組織工程學和再生醫(yī)學領域的研究熱點。E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)在成體組織細胞中廣泛表達,但是在原始干細胞中幾乎不表達。研究發(fā)現(xiàn),在血管內(nèi)皮細胞中,CREG可
3、促進其分泌血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF);而在胚胎干細胞中,過表達CREG可促進其向內(nèi)皮細胞定向分化并形成新生血管。我們的前期體外研究也發(fā)現(xiàn),BMSCs過表達CREG后,能夠在體外對抗病理條件導致的細胞凋亡。但是,在體情況下,CREG基因修飾的BMSCs對急性MI的治療作用及機制均不清楚。因此,本研究擬通過動物體內(nèi)實驗闡明過表達CREG后BMSCs治療MI的效果并探討其
4、機制,為防治心肌梗死提供新的治療手段和理論依據(jù)。
實驗目的:
1.明確過表達CREG的BMSCs移植對大鼠心肌梗死的治療作用;
2.明確過表達CREG的BMSCs移植是否通過促進旁分泌及血管新生發(fā)揮減輕MI損傷的作用;
3.明確CREG是否通過上調(diào)HIF-1α促進BMSCs的旁分泌作用。
實驗方法:
1.過表達CREG的BMSCs建立:利用表達CREG-GFP和GFP的腺病毒分
5、別感染BMSCs,建立CREG過表達的BMSCs(CREGBMSCs)和感染對照組BMSCs(GFPBMSCs)。通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果,當轉(zhuǎn)染效率達95%以上后,可用于進行干細胞移植。2.大鼠MI模型的制備:利用2%異氟烷揮發(fā)性麻藥麻醉大鼠并固定于操作臺上,經(jīng)其左側(cè)胸骨的第4、5肋間將心臟暴露,通過結(jié)扎大鼠的心臟冠脈左前降支(left anterior desending coronary artery,LAD)建立MI模型;然后
6、在梗死心臟邊緣區(qū)域進行5個點注射治療。根據(jù)注射成分的不同將大鼠分為4組,分別是注射對照組(PBS組),普通BMSCs(NormBMSCs)治療組,GFPBMSCs治療組和CREGBMSCs治療組。
3.干細胞移植治療MI后的第3天與14天,
(1)利用小動物超聲測定大鼠心功能;
(2)采用Masson染色檢測小鼠心肌纖維化程度;
(3)利用Western blots方法檢測心肌組織中凋亡指標cle
7、aved Caspase-3表達水平;
(4)利用ELISA方法檢測心肌組織中VEGF的表達水平;
(5)通過共聚焦顯微鏡觀察心肌組織中CD31的表達水平;
4.體外模擬缺氧環(huán)境,通過ELISA方法檢測過表達CREG對BMSCs的旁分泌生長因子影響,同時采用Matrigel方法觀察其對血管新生的影響。
5.通過Western blot方法以及Real-time PCR方法來,探討體外缺氧條件下CR
8、EG調(diào)控BMSCs旁分泌的分子機制。
實驗結(jié)果:
1.體內(nèi)部分
(1)過表達CREG的BMSCs治療組(CREGBMSCs)的大鼠第3天與第14天的射血分數(shù)(ejection fraction,EF)和短軸縮短率(fractional shortening,F(xiàn)S)比PBS組、NormBMSCs治療組以及 GFPBMSCs治療組均有明顯的改善。這一結(jié)果表明,CREG過表達可提高BMSCs移植治療MI的效果,使
9、心功能得到進一步的改善。
(2) CREGBMSCs治療組的大鼠心臟纖維化面積明顯少于PBS組、NormBMSCs治療組和GFPBMSCs治療組。這一結(jié)果表明,CREG過表達的BMSCs移植治療可進一步減少心肌纖維化的發(fā)生,從而延緩心室重構(gòu)。
(3)無論在3天還是14天時間點,CREGBMSCs治療組的大鼠心肌凋亡指標cleaved Caspase-3表達水平明顯低于其他3組。這一結(jié)果表明,CREG過表達BMSCs移
10、植治療可以進一步減少心肌細胞凋亡的發(fā)生。
(4)無論在3天還是14天時間點,CREGBMSCs治療組的大鼠心臟的血管新生都明顯多于其他3組。這一結(jié)果表明,CREG過表達BMSCs移植治療可進一步促進血管新生,從而改善梗死區(qū)微環(huán)境。
(5)過表達CREG能夠延緩移植后BMSCs的凋亡,同時延長VEGF的旁分泌作用。2.體外部分
(1)體外缺氧條件下,CREG過表達可以促進BMSCs分泌VEGF;培養(yǎng) CREG
11、BMSCs的上清液可以促進體外內(nèi)皮細胞血管網(wǎng)的形成。
(2) CREG促進HIF-1α的表達以及核轉(zhuǎn)位。
(3)通過HIF-1α的siRNA抑制實驗證實,CREG通過調(diào)控HIF-1α促進VEGF分泌,進而促進血管新生。
(4)過表達CREG降低VHL(降解HIF-1α的主要分子)mRNA合成,繼而上調(diào)HIF-1α。
實驗結(jié)論:
1.過表達CREG的 BMSCs移植治療能夠進一步提高BMS
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