姜黃素-NO小分子水凝膠治療小鼠心肌梗死.pdf

1、研究背景：
　　近年來，隨著人們生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，以及人口老年化的發(fā)展，心血管疾病已成為威脅人類健康的首要殺手。其中，心肌梗死(myocardialinfarction，MI)是世界上致死率和致殘率最高的疾病之一。MI后，心肌細胞發(fā)生不可逆性死亡，引起MI區(qū)非收縮性瘢痕形成、膠原沉積和細胞外基質(zhì)降解，共同引起心臟形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的非適應(yīng)性改變，稱之為心室重構(gòu)。心室重構(gòu)會逐漸發(fā)展為心力衰竭(heart failure，HF)

2、，大大增加MI患者的再住院率和死亡率。近幾十年來，隨著心臟組織工程和再生醫(yī)學(xué)的迅速發(fā)展，心肌內(nèi)可注射性生物材料，比如水凝膠，展現(xiàn)出良好的心臟組織修復(fù)和促血管再生能力。姜黃素(curcumin，Cur)是一種是從姜科植物提取的多酚類化合物，具有抗炎、抗氧化和抗凋亡等藥理作用。研究證明，姜黃素可抑制壓力負荷或MI所致的心室重構(gòu)，并可改善心功能。然而姜黃素的水溶性差和生物利用度低等缺點制約其臨床的應(yīng)用。一氧化氮(nitric oxide，NO

3、)作為生物體內(nèi)一種重要的氣體信號分子，具有舒張血管、增加冠脈血流量、抑制血小板聚集和促進血管再生等多重心血管保護作用。但是NO分子極其不穩(wěn)定，半衰期短，幾秒內(nèi)失活，嚴重制約其臨床應(yīng)用。目前，已經(jīng)研發(fā)出不少具有高效率地產(chǎn)生和釋放NO的生物材料，具有促進皮膚傷口愈合、改善下肢缺血和促進心肌梗死后血管再生等治療作用。近年來，不少研究表明在缺血性心臟病的治療方面，多種藥物聯(lián)合治療比單藥療效更顯著。因此，研究和制備可控制地釋放姜黃素和NO的小分子

4、水凝膠，一方面提高姜黃素的水溶性和治療效果;另一方面，水凝膠可提供力學(xué)支撐來改善MI后心功能;最后，姜黃素和NO聯(lián)合治療的效果可能具有協(xié)同效應(yīng)。
　　研究目的：
　　制備并評價能在β-半乳糖苷酶(β-gal)催化下釋放一氧化氮的姜黃素—NO小分子水凝膠，并觀察心肌內(nèi)注射水凝膠對心肌梗死后小鼠的心功能、心室重構(gòu)、心肌細胞凋亡及血管新生的影響，并初步探討其作用機制。
　　研究方法：
　　前期實驗已分別合成帶有姜黃素的

5、水凝膠前體化合物Ⅰ(Cur-FFE-ss-ERGD)和帶有NO供體的水凝膠前體化合物Ⅱ(Nap-FFGGG-NO)。現(xiàn)把兩者按一定的摩爾比例（化合物Ⅰ∶化合物Ⅱ=4∶1）混合后并溶于PBS溶液，加熱冷卻后再加入谷胱甘肽還原劑(GSH)，可通過共組裝的方式形成黃色半透明的姜黃素-NO小分子水凝膠(Gel)。流變儀檢測Gel的力學(xué)性能，高分辨透射電鏡(TEM)檢測超微結(jié)構(gòu)，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS)檢測姜黃素從Gel中的釋放，在給予

6、200 U/L的半乳糖苷酶的情況下，用一氧化氮檢測試劑盒檢測NO的重Gel中的釋放。通過結(jié)扎雄性C57/BL6小鼠左前降支冠狀動脈構(gòu)建急性心肌梗死模型，并隨機將其分為3小組，saline組:MI周邊注射20μ L生理鹽水和尾靜脈注射50μl生理鹽水;Gel組:MI周邊注射20μL水凝膠和尾靜脈注射50μ l生理鹽水;Gel+β-gal組:MI周邊注射20μ L水凝膠和尾靜脈注射50μ l濃度為0.4mg/ml的β-半乳糖苷酶溶液。此外，

7、還設(shè)有假手術(shù)組（sham組），開胸和穿線，但不結(jié)扎冠狀動脈，不給予任何溶液或藥物治療。4周后，超聲心動圖檢測心功能，包括射血分數(shù)(EF)、縮短分數(shù)(FS)、左室舒張末內(nèi)徑(LVIDd)和左室收縮末內(nèi)徑(LVIDs)，其中心電圖(ECG)結(jié)果也被記錄下來;然后處死小鼠，迅速取出心臟標本并固定，切成薄片。Masson染色觀察心臟結(jié)構(gòu)和心肌纖維化程度;組織Tunel染色觀察心肌細胞凋亡程度;vWF免疫熒光觀察新生血管密度，免疫組織化學(xué)染色觀察

8、心臟組織SIRT1、TGFβ1和MMP-2表達情況，并每組取出3只新鮮小鼠的心臟組織，研碎后行Western Blot定量分析SIRT1、TGFβ1和MMP-2蛋白的表達。
　　實驗結(jié)果：
　　1.水凝膠的性能:水凝膠外觀呈黃色果凍狀，含有濃度為0.5wt％的化合物Ⅰ和0.17wt％的化合物Ⅱ。它可在室溫下穩(wěn)定保存至少一個月。TEM提示水凝膠為三維(3D)網(wǎng)狀的微觀形貌，由直徑大約為20-80 nm的納米纖維纏繞交織成網(wǎng)絡(luò)狀

9、結(jié)構(gòu)并包裹大量水分子而形成水凝膠。流變儀的頻率掃描(frequencysweep)和張力掃描(strain sweep)均提示彈性模量(G')與粘性模量(G")的比值是一個數(shù)量級以上，說明水凝膠的真正形成，具有較強的彈性和抗壓性;水凝膠可通過酯鍵的水解釋放出姜黃素單體，在常溫下前24小時的累積釋放量大約為2.43μg/mL，占總量的0.84％，說明水凝膠具有持續(xù)緩慢釋放能力。水凝膠在PBS溶液只緩慢釋放姜黃素，給予200 U/L的β-半

10、乳糖苷酶后，可檢測到NO釋放，前48小時的最大累計釋放量占總量的26.14％，且保持低濃度緩慢釋放狀態(tài)，而不加酶的情況，始終檢測不到NO的釋放，說明水凝膠可控性釋放NO。
　　2.超聲心動圖結(jié)果:心梗模型各組心電圖顯示明顯的病理性Q波形成，而非心梗組呈正常的qRs波，表明心肌梗死模型的成功建立（已形成陳舊性心肌梗死）。與sham組相比，saline組、Gel組和Gel+β-gal組的心功能指標FS、EF顯著降低(P＜0.01)，而

11、LVIDd、LVIDs明顯升高(P＜0.05);與saline組比較，Gel組和Gel+β-gal的FS、EF均升高，LVIDd、LVIDs降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與Gel組比較，Gel+β-gal組FS、EF明顯升高，LVIDd、LVIDs明顯降低(P＜0.05)。
　　3.Masson染色結(jié)果:sham組心臟左室腔大小及幾何形態(tài)正常，有極少量纖維化，而saline組左室腔明顯離心性擴大，心室壁明顯變薄，纖維化

12、面積明顯增加（P＜0.01）;與saline組相比，Gel組和Gel+β-gal組室壁厚度有所增加，左室腔變小，纖維化面積減少(P＜0.01);其中，與Gel組比較，Gel+β-gal組心臟形態(tài)更接近正常，纖維化程度更輕(P＜0.05)。
　　4.心肌細胞凋亡結(jié)果:通過Tunel染色提示，sham組心肌細胞排列非常規(guī)整，凋亡陽性心肌細胞的百分比率非常低，而在saline組心肌細胞排列十分紊亂，凋亡率異常升高，兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義

13、（P＜0.01)。Gel組經(jīng)姜黃素治療后凋亡率明顯降低，與saline組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。在Gel+β-gal組，細胞排列接近正常，凋亡率明顯低于Gel組（P＜0.05）。
　　5.心梗區(qū)血管新生情況:與sham組比較，saline組和Gel組血管新生增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05），而在Gel+β-gal中，新生血管密度明顯增加約是其他組兩倍，與其他三組比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）。

14、r>　　6.心肌組織蛋白表達情況:通過組織免疫化學(xué)染色和心臟組織Western Blot檢測提示，與sham組比較，saline組的SIRT1表達降低（P＜0.05），而TGFβ1和MMP2表達增加（P＜0.05);與saline組相比，Gel組和Gel+β-gal組均可增加SIRT1表達（P＜0.05），降低TGFβ1和MMP-2表達(P＜0.05)。與Gel組相比，Gel+β-gal組更明顯增加SIRT1表達，降低TGFβ1和MMP

15、-2表達（P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.成功制備姜黃素-NO小分子水凝膠，具有良好力學(xué)性能，自身可緩慢釋放出姜黃素，而只有額外添加β-半乳糖苷酶才可釋放NO，具有可控性和緩釋效果。
　　2.姜黃素-NO小分子水凝膠可明顯改善小鼠心肌梗死后心功能，減輕心肌纖維化，減輕細胞凋亡和促進血管新生。當水凝膠同時釋放姜黃素和NO時，其治療效果比單獨釋放姜黃素的更好，說明姜黃素與NO在小鼠心肌梗死治療上具有協(xié)同效應(yīng)。