緊密黏附素轉(zhuǎn)移受體Tir在EHEC粘附損傷中的作用研究.pdf

1、腸出血性大腸桿菌(EHEC)O157：H7是一類食源性病原體，能引起一些列人類疾病，如腹瀉、出血性腸炎(HC)和溶血性尿毒綜合征(HUS)等，嚴重癥狀的可導(dǎo)致死亡。EHEC的感染能夠?qū)е翧/E損傷和分泌志賀毒素，目前國內(nèi)外的研究也主要集中在這兩部分。A/E損傷能夠在病原菌粘附宿主細胞位置形成肌動蛋白聚集的“基座”樣結(jié)構(gòu)，并引起與宿主細胞復(fù)雜的相互作用。我們通過對EHEC緊密粘附素轉(zhuǎn)移受體(Tir)的體外表達和Tir缺失突變株的構(gòu)建，研究

2、EHEC與宿主細胞的相互作用，并通過轉(zhuǎn)錄水平的檢測，初步探討其損傷致病機理。
　　 第一部分 EHEC黏附損傷相關(guān)毒力因子Tir、TccP的重組表達與鑒定
　　 EHEC O157：H7緊密粘附素intimin為病原菌定殖及引起A/E損傷的關(guān)鍵因子，而Tir是病原菌自身編碼的intimin受體蛋白。本實驗在基因工程菌中實現(xiàn)腸出血性大腸桿菌(EHEC)O157：H7緊密黏附素受體(Tir)全分子蛋白的高效表達，并對其生物活

3、性初步分析鑒定。應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)釣取tir基因，構(gòu)建了pET-22b(+)-tir表達質(zhì)粒，經(jīng)測序鑒定后轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達，目的蛋白以裂解上清形式表達，表達量約10mg/L。經(jīng)鎳柱純化后純度達90％以上。將FITC標記到重組表達的Tir蛋白上，與HEp-2細胞相互作用，在熒光顯微鏡下觀察Tir能夠嵌入細胞膜，說明我們重組制備的蛋白具有生物學(xué)活性，為進一步研究Tir與Int281相互作用及其在粘附中作

4、用奠定基礎(chǔ)。
　　 TccP是緊密粘附素受體與細胞骨架聯(lián)接蛋白。在EHEC中參與A/E損傷的形成，起到類似Nck蛋白的作用。應(yīng)用原核表達系統(tǒng)構(gòu)建并表達了TccP蛋白。所得到包涵體形式的TccP蛋白，采用鹽酸胍變性、梯度尿素復(fù)性的方法得到可溶形式的TccP蛋白，純度達到85％以上。
　　 第二部分 Tir、TccP、Int281分子間相互作用及Tir在細胞粘附中的作用研究
　　 Intimin是EHEC外膜蛋白，它

5、在病原菌的粘附過程中起重要作用。Intimn的受體包括病原菌LEE毒力島編碼的Tir以及宿主自身受體蛋白nucleolin和β1-integrin。已有研究認為，intimin與Tir相互作用所產(chǎn)生的信號誘導(dǎo)了A/E損傷的形成。失去了與intimin結(jié)合區(qū)域的Tir蛋白依然能夠嵌入細胞膜，并能夠使酪氨酸磷酸化，但不能誘導(dǎo)肌動蛋白的聚集。
　　 在這部分工作中，針對EHEC與宿主細胞相互作用中存在多種受體，我們嘗試分別在分子和細胞

6、水平闡明受體Tir在EHEC黏附中的作用。首先利用本室前期重組表達的Int281，通過分子相互作用分析，比較Tir、integrin受體的結(jié)合能力。我們用重組Tir蛋白免疫兔子，制備效價>106免疫血清。然后利用ELISA方法驗證Int281與Tir具有結(jié)合活性，且結(jié)合能力大小與蛋白濃度相關(guān)。進一步，利用SPR技術(shù)，采用氨基耦聯(lián)方式將蛋白Tir耦聯(lián)于CM5芯片表面。利用BIAevalution分析軟件處理數(shù)據(jù)，顯示Int281與Tir結(jié)

7、合量，計算出EHEC來源的Int281與Tir親和力常數(shù)為KD：1.28E-8(12.8nM)，表明Tir是Intimin的特異高親和力受體。利用ELISA原理測定integrin與Int281、TccP與Tir相互作用，發(fā)現(xiàn)過量的integrin與Int281具有結(jié)合活性，而TccP與Tir不具有結(jié)合活性；SPR技術(shù)測定結(jié)果同樣證實：integrin與Int281的結(jié)合活性很弱、而TccP與Tir不發(fā)生直接相互作用，表明宿主細胞自身的

8、膜蛋白integrin是Intimin的弱親和力受體。
　　 為了進一步了解受體Tir在EHEC細胞粘附中的作用，我們利用Red重組系統(tǒng)構(gòu)建了tir基因缺失突變株，發(fā)現(xiàn)構(gòu)建含有tir基因上、下游各500bp同源臂具有更高的重組效率。在得到tir基因缺失突變株△tir：EHEC的基礎(chǔ)上，以HEp2細胞為模型，將不同數(shù)量級的野生型EHEC與△tir：EHEC分別與細胞作用，利用平板計數(shù)方法測定粘附到細胞上菌落數(shù)量。發(fā)現(xiàn)△tir：EH

9、EC在粘附數(shù)量上均明顯少于野生型EHEC(P<0.01)。并且當(dāng)補加重組Tir蛋白(Tir終濃度小于30ng/μl)后，△tir：EHEC粘附數(shù)量明顯上升(P<0.01)。這表明EHEC自身受體Tir做為高親和力受體與宿主提供受體如integrin等相比，在EHEC粘附中起著更重要的作用。
　　 第三部分 Tir對A/E損傷細胞模型相關(guān)基因表達豐度的影響
　　 EHEC能夠誘導(dǎo)宿主細胞發(fā)生A/E損傷，它引起宿主細胞肌動蛋

10、白大規(guī)模的重排，涉及一系列細胞骨架及其它相關(guān)蛋白。A/E損傷最顯著的特點是在上皮細胞表面細菌粘附位置處形成一個上升的“基座”樣結(jié)構(gòu)。Tir是已知的形成A/E損傷關(guān)鍵TTSS效應(yīng)器蛋白，在EHEC中，近來又發(fā)現(xiàn)第二個關(guān)鍵效應(yīng)蛋白，即TccP。EHEC需要TccP來彌補因缺乏相應(yīng)Y474，而導(dǎo)致的不能激活Nck途徑。TccP正是起著類似Nck蛋白的作用。Tir通過其N末端和C末端區(qū)域和許多宿主蛋白相互作用，如a-actinin、talin、

11、vinculin等。這些蛋白通常以直接方式作用于質(zhì)膜磷酸酯層，或以間接方式作用于和質(zhì)膜相聯(lián)系的蛋白，以此聯(lián)系著細胞膜和骨架蛋白。
　　 在這部分工作中，我們試圖通過在體外細胞水平上，對發(fā)生由EHEC感染所引起A/E損傷的HeLa細胞進行mRNA水平檢測，并且以我們構(gòu)建的tir缺失突變株△tir：EHEC同樣感染HeLa細胞，來探索Tir與宿主細胞蛋白如肌動蛋白、a-actinin等在轉(zhuǎn)錄水平上的關(guān)系。
　　 我們首先建立

12、EHEC O157感染HeLa細胞誘發(fā)A/E損傷的模型。用野生型EHEC和△tir：EHEC分別感染HeLa細胞，對感染條件進行摸索，發(fā)現(xiàn)在106CFU感染劑量以及4小時感染時間內(nèi)，A/E損傷特征性“基座”現(xiàn)象最明顯，利用激光共聚焦顯微鏡可觀察野生型EHEC菌株O157：H7 EDL933對效應(yīng)細胞造成典型的A/E損傷，肌動蛋白聚集重排；而△tir：EHEC明顯喪失了致HeLa細胞A/E損傷的能力。在此細胞模型基礎(chǔ)上，我們進一步通過提取

13、感染后HeLa細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以cDNA為模板，利用實時熒光定量PCR技術(shù)，檢測a-actin、a-actinin兩個基因mRNA水平上的表達豐度變化。結(jié)果顯示a-actin、a-actinin兩個基因mRNA水平在兩組感染中均下調(diào)(p<0.01)。且a-actin基因mRNA水平在△tir：EHEC感染組下降趨勢大于野生型EHEC感染組(p<0.01)。野生型EHEC感染組a-actinin基因mRNA水平在感染后1

14、小時急劇下降，mRNA相對值小于△tir：EHEC感染組(p<0.01)；而1小時之后，EHEC感染組a-actinin基因mRNA水平略有回升，在2小時之后持續(xù)下降，且mRNA相對值大于△tir：EHEC感染組(p<0.01)。結(jié)果顯示在EHEC感染HeLa細胞過程中，Tir對a-actin和a-actinin基因mRNA表達水平有影響，相關(guān)機制有待進一步研究。
　　 本研究通過對Tir重組表達及tir基因缺失突變株構(gòu)建，進一