晚期糖化終產(chǎn)物受體在炎癥性血管損傷中的作用.pdf

1、已有研究資料表明炎癥性血管損傷是動脈粥樣硬化性心血管疾病(CVD)和2型糖尿病的共同病理過程，但是炎癥性血管損傷的機制至今仍不十分清楚。近年研究發(fā)現(xiàn)晚期糖化終產(chǎn)物受體(RAGE)與炎癥性血管損傷有關(guān)，本研究應(yīng)用反義RNA和基因芯片等技術(shù)進一步探討RAGE在炎癥性血管損傷中的作用及其機制，尋找與RAGE作用相關(guān)的基因，為防治炎癥性血管損傷提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。 一、糖尿病人外周血單核細胞RAGE的表達及其與血清炎癥因子的關(guān)系

2、 應(yīng)用流式細胞術(shù)(FCM)檢測糖尿病患者外周血單核細胞RAGE蛋白的表達，分析RAGE水平與血清炎癥因子的關(guān)系。結(jié)果顯示2型糖尿病患者外周血單核細胞RAGE的蛋白表達率為54.7％±8.9％，較正常對照組明顯增加。直線相關(guān)分析顯示RAGE蛋白表達率與TNF-α和IL-6呈正相關(guān)。多元逐步回歸分析示TNF-α和糖基化血紅蛋白為影響：RAGE蛋白表達率的顯著因素。 二、RAGE、PDGF-β在SD大鼠頸動脈球囊損傷后內(nèi)膜中的表達

3、 建立SD大鼠頸動脈球囊損傷模型，檢測RAGE、PDGF-β在頸動脈球囊損傷后內(nèi)膜中的表達，并應(yīng)用腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的大鼠RAGE反義RNA局部處理觀察RAGE在炎癥性血管損傷中的作用。結(jié)果顯示大鼠頸動脈球囊損傷后14 d后新生內(nèi)膜組織中RAGE、PDGF-β表達明顯增強。成功構(gòu)建了大鼠RAGE反義RNA腺相關(guān)病毒表達載體，并獲得8.7×10<'7>個病毒顆粒/mL的病毒原液。應(yīng)用體外動脈環(huán)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在感染RAGE反義RNA腺相關(guān)病

4、毒的頸動脈球囊損傷后內(nèi)膜中RAGE的表達下降，同時PDGF-β的表達也下降。 三、RAGE的表達水平對ECV304細胞分泌炎癥因子功能的影響 應(yīng)用FCM和RT-PCR檢測晚期糖化終產(chǎn)物(AGEs)對ECV304細胞RAGE表達的影響，結(jié)果顯示不同濃度的AGEs作用ECV304細胞24 h，RAGE的mRNA和蛋白表達較未刺激前明顯增加。應(yīng)用基因重組技術(shù)構(gòu)建人RAGE反義RNA真核表達載體，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染入ECV304細胞

5、，經(jīng)抗性基因篩選陽性克隆，F(xiàn)CM鑒定，建立低表達RAGE的ECV304細胞克隆。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染RAGE反義RNA的細胞克隆中RAGE表達被抑制58.2％±7.1％。RAGE反義RNA減輕AGEs刺激ECV304細胞分泌TNF-α、IL-6。 四、轉(zhuǎn)染RAGE反義RNA對ECV304細胞基因表達譜的影響 應(yīng)用Affymetrix公司生產(chǎn)的人類基因表達譜芯片檢測轉(zhuǎn)染RAGE反義RNA對ECV304細胞基因表達譜的影響，并驗證部

6、分基因芯片結(jié)果。結(jié)果顯示在RAGE高表達的細胞中表達上調(diào)達2倍的有245個基因，表達下調(diào)達2倍的有186個基因。結(jié)合生物學(xué)功能分析顯示RAGE的下游基因中與炎癥反應(yīng)相關(guān)的基因如整合素β1(ITGB1)、基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP3)、凝血酶敏感蛋白-1(THBS1)、前列腺素G/H合成酶即環(huán)氧化酶(PTGS2)等明顯上調(diào)。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的信號分子，如磷脂酶Cβ1(PLCβ1)、磷脂酶Cβ4(PLCβ4)、鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅳ(CAMK Ⅳ

7、)等基因明顯上調(diào)?；蛐酒Y(jié)果顯示多種轉(zhuǎn)錄因子基因表達上調(diào)及許多變化顯著的未知功能基因、表達序列標簽(EST)。 五、磷脂酶C、鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅳ在RAGE胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的作用 在基因芯片研究基礎(chǔ)上，利用磷脂酶C(PLC)抑制劑研究PLC在AGEs-RAGE通路引起ECV304細胞胞漿游離鈣濃度改變中的作用，結(jié)果顯示PLC抑制劑抑制RAGE介導(dǎo)的細胞內(nèi)游離Ca<'2+>增加。構(gòu)建顯性負突變的CAMK Ⅳ(DN-C