晚期糖化終產(chǎn)物受體介導(dǎo)β-淀粉樣蛋白損傷血腦屏障的機(jī)制及銀杏葉提取物對(duì)其干預(yù)研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種以認(rèn)知功能障礙為主要臨床表現(xiàn)的進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)退行性疾病，是癡呆的最常見(jiàn)類型。β-淀粉樣蛋白（amyloidβ peptide，Aβ）沉積在腦實(shí)質(zhì)引起CNS損傷是AD的特征性病理改變。越來(lái)越多的研究表明，除引起CNS損傷外，Aβ沉積在腦微血管壁引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血腦屏障（blood-brain barrier, B

2、BB）功能障礙也是AD的重要病理改變，然而AD中BBB損傷的機(jī)制尚不清楚。研究認(rèn)為Aβ沉積在腦血管系統(tǒng)，破壞BBB結(jié)構(gòu)完整性，BBB屏障功能損傷及腦血流(cerebral blood flow, CBF)減少，腦組織氧和營(yíng)養(yǎng)不足，腦內(nèi)毒性代謝產(chǎn)物堆積，從而加速AD病變進(jìn)展。鑒于BBB在AD發(fā)病中的重要作用，本課題擬從BBB病變?nèi)胧?，研究Aβ?lián)p傷BBB的可能機(jī)制，并通過(guò)觀察銀杏葉提取物(extract ofginkgo biloba，EG

3、b)對(duì)該損傷途徑的干預(yù)影響，以期為探索AD的防治手段提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　BBB是機(jī)體的重要屏障之一，對(duì)維持腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、保證大腦正常功能極為重要。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(brain microvascular endothelial cells，BMEC)是BBB的基本骨架，具有區(qū)別于外周血管內(nèi)皮的獨(dú)有特征。在高度分化的神經(jīng)血管系統(tǒng)中，BMEC以其顯著的特異性在BBB屏障特性及物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能中發(fā)揮著重要作用。BBB屏障功能及其低滲性主要依

4、賴于內(nèi)皮間緊密連接(tightj unction，TJ)，后者是BBB屏障功能的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，在保持內(nèi)皮生理屏障和低通透性方面具有關(guān)鍵作用。因此各種原因引起的TJ破壞都將導(dǎo)致BBB損傷，繼而CNS內(nèi)環(huán)境紊亂，最終加速中樞病變進(jìn)展。TJ主要由相關(guān)鉸鏈蛋白ZO（ZO-1、2、3）、Claudin(Claudin-1、3、5、12)、Occludin構(gòu)成。BBB結(jié)構(gòu)完整性與TJ正常組合開(kāi)放及關(guān)閉有關(guān)，TJ蛋白表達(dá)減少或蛋白分布異常均能引起TJ

5、結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致BBB結(jié)構(gòu)完整性破壞，BBB通透性增加。尸檢研究證實(shí)AD患者存在BBB結(jié)構(gòu)完整性受損，TJ蛋白水平顯著減少。在體動(dòng)物及體外細(xì)胞研究也發(fā)現(xiàn)Aβ可引起TJ蛋白水平下降，BBB通透性增加。
　　晚期糖化終產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end-products，RAGE）是晚期糖化終產(chǎn)物(advanced glycation end-products，AGEs)的一種特征性細(xì)胞表面

6、受體，屬于免疫球蛋白超家族成員。健康成人中，除在肺組織以外，RAGE僅有極微量表達(dá)。RAGE除與AGEs結(jié)合外，還能與高速泳動(dòng)族盒蛋白-1(highmobility group box1，HMGB-1)、S100/鈣粒蛋白家族、Aβ等多種配體結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞生命活動(dòng)。近年研究發(fā)現(xiàn)，在CNS，Aβ通過(guò)RAGE下游信號(hào)通路激活氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等損傷途徑，從而活化小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥效應(yīng)，損傷神經(jīng)元。Aβ-RAGE相互作用還能激活核因子-κB(nuc

7、lear factor-κB，NF-κB)，引起RAGE表達(dá)增加，從而激活A(yù)β介導(dǎo)的正反饋損傷效應(yīng)。可見(jiàn)，腦內(nèi)RAGE表達(dá)上調(diào)與AD神經(jīng)元損傷相關(guān)。此外，BMEC上極微量表達(dá)的RAGE是參與BBB轉(zhuǎn)運(yùn)Aβ的重要載體之一，其與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白-1(LDH receptor related protein，LRP-1)協(xié)同維持腦內(nèi)Aβ正常水平。LRP-1將腦內(nèi)Aβ轉(zhuǎn)運(yùn)至外周血液循環(huán)，繼而經(jīng)肝臟代謝清除，RAGE則將血液中Aβ轉(zhuǎn)運(yùn)入腦

8、沉積。在AD中，LRP-1表達(dá)減少，RAGE含量顯著增加。然而，RAGE在AD BBB損傷中的作用仍不十分清楚。據(jù)此，本研究提出猜想，RAGE是否也與Aβ誘導(dǎo)BBB損傷過(guò)程有關(guān)，其相關(guān)調(diào)控機(jī)制如何？
　　研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)與多種病變引起的BBB通透性增加有關(guān)，而抑制MMP活性能阻斷BBB損傷途徑。如腦卒中動(dòng)物模型ZO-1、Claudin-5、Occludin蛋白

9、水平降低，敲除MMP-9能改善上述TJ蛋白水平。置于脈沖電磁場(chǎng)（pulsed electromagnetic field，PEMF）中的小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞MMP-2、MMP-9表達(dá)增加，ZO-1水平明顯減少，BBB通透性增加，而抑制MMP-2、MMP-9活性可阻斷PEMF引起的BBB損傷。據(jù)此我們推測(cè)，AD中BBB損傷可能與Aβ誘導(dǎo)MMP表達(dá)有關(guān)，后者通過(guò)酶降解作用引起TJ蛋白含量減少，引起TJ正常結(jié)構(gòu)破壞及BBB通透性增加。
　

10、　因此，本課題采用小鼠BMEC單培養(yǎng)方式建立BBB細(xì)胞模型，觀察Aβ1-42對(duì)BBB的影響并探討RAGE在Aβ1-42介導(dǎo)BBB損傷中的作用及其可能機(jī)制，同時(shí)觀察EGb對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)BBB損傷的干預(yù)作用。
　　本課題主要結(jié)果如下:
　　(一)RAGE介導(dǎo)Aβ1-42損傷BBB的機(jī)制研究
　　1.Aβ1-42誘導(dǎo)BMEC細(xì)胞損傷
　　Aβ1-42誘導(dǎo)BMEC細(xì)胞損傷:MTT結(jié)果顯示Aβ1-42降低BMEC細(xì)胞活

11、力。三種形態(tài)Aβ1-42中，Aβ1-42單體(Aβ1-42-monomer, Aβ1-42-Mono)、寡聚態(tài)Aβ1-42(Aβ1-42-oligomer，Aβ1-42-Oligo)及纖維狀A(yù)β1-42(Aβ1-42-fibrils，Aβ1-42-Fibril)均能降低BMEC細(xì)胞活力。Aβ1-42-Oligo細(xì)胞毒性較Aβ1-42-Mono與Aβ1-42-Fibril顯著，Aβ1-42-Oligo呈時(shí)間依賴性和濃度依賴性誘導(dǎo)BMEC細(xì)

12、胞活力下降。
　　2.Aβ1-42誘導(dǎo)BBB細(xì)胞模型通透性增加
　　Aβ1-42誘導(dǎo)BBB模型通透性增加:通過(guò)BMEC單培養(yǎng)方式建立BBB細(xì)胞模式，檢測(cè)熒光素鈉(sodium fluorescein，Na-F，MW:376 Da)吸光值分析BBB細(xì)胞模型通透性變化，結(jié)果顯示三種成分Aβ1-42均可誘導(dǎo)BBB模型通透性增加，Aβ1-42-Mono組Na-F吸光值為對(duì)照組的4.3倍，Aβ1-42-Oligo組Na-F吸光值為對(duì)照

13、組的8.2倍，Aβ1-42-Fibril組Na-F吸光值為對(duì)照組的1.7倍;Aβ1-42-Oligo呈時(shí)間依賴性和濃度依賴性誘導(dǎo)單細(xì)胞層BBB模型通透性增加。
　　3.Aβ1-42誘導(dǎo)TJ蛋白水平下降
　　(二）EGb干預(yù)Aβ1-42-Oligo誘導(dǎo)BBB損傷的研究
　　1.EGb抑制Aβ1-42-Oligo誘導(dǎo)BMEC細(xì)胞損傷EGb改善BMEC細(xì)胞活力:通過(guò)MTT檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果顯示，EGb濃度依賴性抑制Aβ1-4

14、2-Oligo引起的BMEC細(xì)胞活力的降低，EGb濃度為100μg/ml時(shí)BMEC細(xì)胞活力為對(duì)照組的97.01％，EGb濃度200μg/ml時(shí)BMEC細(xì)胞活力為對(duì)照組的95.13％。
　　2.EGb抑制Aβ1-42-Oligo誘導(dǎo)BMEC細(xì)胞凋亡
　　EGb抑制細(xì)胞凋亡發(fā)生:Hoechst-33258染色顯示EGb抑制Aβ1-42-Oligo誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡發(fā)生，降低Aβ1-42-Oligo引起的BMEC細(xì)胞凋亡比例。

15、　　3.EGb抑制Aβ1-42-Oligo誘導(dǎo)BMEC細(xì)胞內(nèi)ROS生成
　　EGb抑制細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成:H2DCF-DA熒光染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平，結(jié)果顯示EGb抑制Aβ1-42-Oligo誘導(dǎo)的BMEC胞內(nèi)ROS生成。
　　結(jié)論:
　　1) Aβ能引起B(yǎng)BB細(xì)胞模型通透性增加，Aβ-Oligo可能是AD中引起該損傷效應(yīng)的主要Aβ成分。
　　2) RAG

16、E是介導(dǎo)Aβ?lián)p傷BBB的重要環(huán)節(jié)，Aβ-RAGE相互作用引起TJ蛋白損傷，BBB細(xì)胞模型通透性增加，其機(jī)制與誘導(dǎo)BMEC損傷及上調(diào)MMP-2、MMP-9及RAGE自身表達(dá)增加相關(guān)。
　　3) EGb對(duì)Aβ誘導(dǎo)BBB損傷具有保護(hù)作用，能保護(hù)TJ蛋白，降低BBB細(xì)胞模型通透性，其機(jī)制與抑制Aβ毒性誘導(dǎo)BMEC損傷及抑制RAGE表達(dá)相關(guān)。
　　通過(guò)比較三種不同成分Aβ對(duì)BBB的影響，本研究首次闡述Aβ1-42-Oligo可能是AD