樹突狀細(xì)胞在炎癥性腸病中的作用的研究.pdf

1、免疫反應(yīng)過于強(qiáng)烈與IBD的發(fā)生有關(guān)，而DC在免疫反應(yīng)中起提呈抗原及免疫調(diào)節(jié)的作用，DC是機(jī)體免疫反應(yīng)的始動(dòng)者，在免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)中具有獨(dú)特的地位。對(duì)DC的研究不僅有助于深刻了解機(jī)體免疫應(yīng)答的調(diào)控機(jī)制，而且可以通過調(diào)節(jié)DC的功能來調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答。 第一部分 BaIb/c小鼠結(jié)腸炎模型建立的研究 研究方法： 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：使用SPSS10.0軟件進(jìn)行one-way方差分析，Dunnett法進(jìn)行多重比較，P<0.05為

2、差異有顯著性意義。 選用SPF級(jí)雌性Balb/c小鼠50只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，每組10只，對(duì)照組予以300 g/L乙醇溶液灌腸1次；其他4組分別給予含25 mg/kg，50 mg/kg，100 mg/kg，150 mg/kg 2，4，6-三硝基苯磺酸的300g/L乙醇溶液灌腸1次。各組于造模后3，7，21，28 d各處死1只小鼠，觀察結(jié)腸的大體形態(tài)。造模后21d觀察各組小鼠結(jié)腸的病理組織切片，并檢測(cè)中性粒細(xì)胞的髓過氧化物酶

3、活性。 結(jié)果：造模過程中50，100，150 mg/kg 2，4，6-三硝基苯磺酸組各死亡2，3，3只小鼠。①各組小鼠造模后的一般情況：對(duì)照組及25 mg/kg 2，4，6-三硝基苯磺酸組小鼠發(fā)生一過性的結(jié)腸機(jī)械損傷表現(xiàn)，出現(xiàn)便血等現(xiàn)象，但3～7 d后開始緩解；而50～150 mg/kg 2，4，6-三硝基苯磺酸組小鼠出現(xiàn)便血，腹瀉。②各組小鼠結(jié)腸的大體形態(tài)損傷及病理組織學(xué)觀察結(jié)果：對(duì)照組和25 mg/kg2，4，6-三硝基苯磺

4、酸組小鼠腸道在第7天時(shí)表現(xiàn)為無粘連，局部充血，腸壁不增厚，未見潰瘍，于第3周時(shí)局部充血已好轉(zhuǎn)；結(jié)腸病理切片大致正常。50～150 mg/kg 2，4，6-三硝基苯磺酸組小鼠腸道肉眼可見粘連，腸腔增大，充血水腫，潰瘍形成，出現(xiàn)腸道增厚，病理切片見黏膜下層水腫，固有層炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等現(xiàn)象，以上現(xiàn)象于造模4周后開始緩解。其中當(dāng)2，4，6-三硝基苯磺酸劑量為100 mg/kg時(shí)作用達(dá)到高峰。③各組小鼠的中性粒細(xì)胞髓過氧化物酶活性比較：對(duì)照組，25

5、，50，100，150 mg/kg 2，4，6-三硝基苯磺酸組MPO均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差分別為：0.29±0.12，0.23±0.08，0.85±0.20，1.11±0.14，1.09±0.09，進(jìn)行Dunett多重比較50，100，150 mg/kg 2，4，6-三硝基苯磺酸組MPO致均顯著高于對(duì)照組。 結(jié)論：應(yīng)用含100 mg/kg 2，4，6-三硝基苯磺酸的300g/L乙醇溶液灌腸是誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎較為理想的方法。 第二部分

6、樹突狀細(xì)胞在小鼠結(jié)腸炎中的表型變化及IL-2表達(dá)的研究 方法： 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：使用SPSS10.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有顯著性意義。 從小鼠脾臟中提取樹突狀細(xì)胞的研究 (一)磁珠分離小鼠脾臟樹突狀細(xì)胞的研究方法CD11c單克隆抗體(N418)對(duì)小鼠脾臟樹突狀細(xì)胞上表達(dá)的白細(xì)胞整合素axb2中的ax亞單位是特異性的，有報(bào)道認(rèn)為CD11c在NK細(xì)胞，B細(xì)胞，T細(xì)胞和小鼠骨髓中的髓樣細(xì)胞中也有微

7、量表達(dá)，應(yīng)用CD11c磁珠能夠快速有效的分離占小鼠脾細(xì)胞1％的脾臟樹突狀細(xì)胞。 1．樣品準(zhǔn)備將已分離的脾臟置于6cm平皿內(nèi)，然后把組織用剪刀剪成小碎片。用注射器活塞將所有溶液(包括碎片和細(xì)胞)輕輕通過70um(400目)細(xì)胞篩網(wǎng)用15ml離心管收集所有細(xì)胞，并加入紅細(xì)胞裂解液4度5min，離心細(xì)胞(1000r，10min)，并用buffer沖洗細(xì)胞一次(1000rpm，10min)。2．，磁性標(biāo)記細(xì)胞記數(shù)(記數(shù)板4個(gè)角4大格細(xì)胞

8、數(shù)的平均數(shù)乘以10000)。每10×8個(gè)細(xì)胞加入400ulbuffer(為得到高純度的DC，在加入磁珠前可加入小鼠IgG1mg/500ul)。加入磁珠100ul/10×8細(xì)胞。混勻以后孵育15min，4-8度，加入bufferl-2ml/10×8細(xì)胞，離心細(xì)胞1200r，10min后用習(xí)慣吸去上清液。用500ulbuffer重懸細(xì)胞。3．磁性分選把ms柱放入磁場(chǎng)。500ulbuffer濕潤(rùn)柱子。將細(xì)胞懸液加入柱子。收集通過柱子的陰性細(xì)胞

9、，并用500ulbuffer沖洗柱子，共3次(每次需待液體流盡)。移走柱子，加入bufferlml，并用配套活塞將陽性細(xì)胞從柱子中沖洗出來。如有必要可以重復(fù)以上步驟。 (二)貼壁法分離小鼠脾臟樹突狀細(xì)胞的研究方法 小鼠脾臟樹突狀細(xì)胞是Steiman和Cohn等人于1973年首次分離獲得的，早期的方法主要是利用樹突狀細(xì)胞的半粘附性，頸椎脫臼處死健康小鼠，置70％乙醇浸泡2分鐘，無菌取出脾臟，置于200目銅網(wǎng)上研碎，RPMI-1

10、640沖洗銅網(wǎng)，并收集細(xì)胞懸液，加至r=1.080的細(xì)胞分層劑上將已分離的脾臟置于6cm平皿內(nèi)，然后把組織用剪刀剪成小碎片。用注射器活塞將所有溶液(包括碎片和細(xì)胞)輕輕通過70um(400目)細(xì)胞篩網(wǎng)用15ml離心管收集所有細(xì)胞，并加入紅細(xì)胞裂解液4度5min，離心細(xì)胞，1000rpm，10min，制作成單個(gè)核細(xì)胞，重懸于5％小牛血清-1640培養(yǎng)液中，使細(xì)胞濃度達(dá)10<'7>/ml，將細(xì)胞懸液緩緩加入小鼠淋巴細(xì)胞分層液中，1500rp

11、m，10min。吸取界面云霧狀細(xì)胞層。1640洗滌兩次，制作成3-5×106/ml的細(xì)胞懸液。置于100mm平皿中，5％CO<,2>，37℃培養(yǎng)2h，在用1640培養(yǎng)液洗滌一次，除去非黏附細(xì)胞，貼壁細(xì)胞假如5％小牛血清-1640培養(yǎng)液5％CO<,2>，37℃培養(yǎng)16h，樹突狀細(xì)胞脫黏附，輕搖之，吸取懸液。 將提取出的樹突狀細(xì)胞分別用Fitc-CD11c抗體標(biāo)記，送檢流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)其Fitc-CD11c含量及數(shù)量。 方法

12、1:從脾臟中利用CD11c標(biāo)記的磁珠分離獲得樹突狀細(xì)胞后，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各個(gè)標(biāo)本分別直接進(jìn)行Fitc-CD80，PE-CD86，PE-CD83抗體標(biāo)記后送檢流式細(xì)胞術(shù)。 方法2:將脾臟制作成單個(gè)核細(xì)胞懸液，去紅細(xì)胞后，將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各個(gè)標(biāo)本利用CD11c抗體和Fitc-CD80，PE-CD86，PE-CD83抗體聯(lián)合標(biāo)記后送檢流式細(xì)胞術(shù)。 流式細(xì)胞術(shù)方法：取大于10<'5>個(gè)細(xì)胞置于尖底管中，分別加入擬標(biāo)記的熒光抗體，

13、4度孵育15-30min。用PBS離心沖洗細(xì)胞一次1000rpm，5min。加入適量PBS待測(cè)。若標(biāo)本放置時(shí)間大于3小時(shí)，需加入固定液固定。 RT-PCR檢測(cè)樹突狀細(xì)胞白介素-2因子的表達(dá)的研究 從分離的樹突狀細(xì)胞及同源淋巴細(xì)胞及結(jié)腸組織中分別提取RNA。引物合成：GAPDH：5’-agacagccgcatcttcttgt-3’，3’-tctccatggtggtgaagaca-5’產(chǎn)物長(zhǎng)度361bplL-2:5’-aac

14、ctgaaactccccaggat-3’，3’-tccaccacagttgctgactc-5’產(chǎn)物長(zhǎng)度254bp在勻漿器中研磨，加入1ml Trizol抽打勻漿，移入1.5ml新離心管冰上孵育5分鐘，加入0.2 mL氯仿，震蕩，冰上孵育5分鐘，4℃離心12000g，15分鐘。取上層液相移入1.5mL新離心管重，加入等體積異丙醇，震蕩，冰上孵育10分鐘，4℃離心12000rpm，10分鐘，棄去上清液，加入1mLDEPC水處理過的75％乙醇

15、，震蕩搖勻，4℃，離心7500rpm，5分鐘，棄去上清液，室溫下使之干燥。加入DEPC處理水10μL--35μL溶解RNA。走RNA變性電泳觀察18s、28s條帶，分光光度計(jì)檢測(cè)260/280吸光度比值，計(jì)算RNA濃度。取等量的實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組總RNA(總量不超過500ng)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。取適量PCR產(chǎn)物與5×loading buffer混和后在1.5％瓊脂糖，80v電壓下進(jìn)行電泳。 結(jié)論： 1、利用磁珠分選樹突狀

16、細(xì)胞CD11c陽性率較普通貼壁法分選樹突狀細(xì)胞CD11c陽性率高，當(dāng)連續(xù)使用多跟MS柱時(shí)，陽性率可達(dá)99％，是樹突狀細(xì)胞分選提純的首選方法。 2、本研究發(fā)現(xiàn)在炎癥性腸病疾病模型的小鼠脾臟中樹突狀細(xì)胞表面標(biāo)志CD80，CD86，CD83較正常組小鼠均有升高，提示樹突狀細(xì)胞已趨于成熟，而樹突狀細(xì)胞成熟度增高提示其抗原提呈功能的發(fā)揮。 3、本研究發(fā)現(xiàn)在整個(gè)結(jié)腸炎的致病過程中IL-2的表達(dá)水平增高，DC中IL-2的表達(dá)水平增高，