IL-17-IL-17R通路在炎癥性腸病中的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　炎癥性腸病(Inflammatory Bowel Diseases,IBD)是一種病因尚不明確的慢性腸道炎癥性疾病,包括潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis,UC)和克羅恩病(Crohn's Diseases,CD)兩種。IBD在西方國家相當(dāng)常見,患病率達(dá)100-200/10萬。近10年,我國炎癥性腸病的發(fā)病率上升大約10-20倍。鑒于IBD嚴(yán)重危害患者的健康且發(fā)生惡變的概率明顯高于正常人,該類疾病越來越

2、受到人們的關(guān)注。
　　在發(fā)病機(jī)制上目前認(rèn)為IBD是由環(huán)境、遺傳、感染及免疫等多因素相互作用所致,已知腸道粘膜免疫系統(tǒng)異常所導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)在IBD發(fā)病中起重要作用。最初認(rèn)為CD4+Thl/Th2細(xì)胞亞群的失衡與CD和UC的發(fā)生密切相關(guān)。近年來一種新型CD4+T細(xì)胞亞群Th17細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子IL-17在炎癥性腸病中的作用逐漸被研究者所關(guān)注。如IBD的臨床病例顯示,UC和CD病人結(jié)腸粘膜組織IL-17分泌細(xì)胞的水平明顯高于正常;

3、IBD病人外周血中IL-17的含量也明顯升高,這提示IL-17可能在IBD的發(fā)病過程中發(fā)揮病理性作用。隨后眾多的研究探討了IL-17作為IBD干預(yù)靶點(diǎn)的可行性。然而后來的研究發(fā)現(xiàn)利用IL-17的單抗對IBD進(jìn)行臨床治療并未取得預(yù)期的治療效果,這提示11-17在炎癥性腸病中具有復(fù)雜的作用,要干預(yù)IL-17在IBD中的病理性作用仍需要對其作用機(jī)制進(jìn)行深入的探討。
　　已知IL-17可通過活化MAPKp38等通路誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的聚集等機(jī)

4、制促進(jìn)炎癥反應(yīng)。Actl(activator of NF-KB)是IL-17信號(hào)通路中一種重要的接頭蛋白,參與了IL-17誘導(dǎo)的MAPK通路分子的活化。但在炎癥性腸病中,Actl分子是否以及如何參與IL-17介導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞的活化,其機(jī)制如何等是目前尚不十分清楚的課題。另一方面,也有資料顯示IL-17能在炎癥性腸病中發(fā)揮保護(hù)作用。我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)UC中IL-17的表達(dá)升高,而Thl細(xì)胞的活性顯著降低,IL-17是否通過抑制Thl細(xì)胞

5、的活性發(fā)揮免疫保護(hù)作用,其機(jī)制如何是目前尚不清楚而又非常值得探討的內(nèi)容。因此,深入認(rèn)識(shí)IL-17介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)作用的機(jī)制將為以IL-17為靶點(diǎn)的炎癥性腸病的免疫干預(yù)策略提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目的:
　　鑒于結(jié)細(xì)胞(Colonic Epithelia Cell,CEC)是IBD累及的主要靶細(xì)胞,且是重要的局部免疫反應(yīng)介導(dǎo)細(xì)胞。因此我們以CEC為對象,研究IL-17在CEC中的效應(yīng)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,探討IL-17在腸道介導(dǎo)雙重作

6、用的分子機(jī)制,從而為基于IL-17的臨床疾病干預(yù)提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法及結(jié)果:
　　1.我們首先以CEC細(xì)胞系HT-29細(xì)胞為模型,通過real-time PCR及Western Blot方法探討了IL-17促進(jìn)HT-29細(xì)胞活化介導(dǎo)促炎因子表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。我們的結(jié)果表明,IL-17對HT-29細(xì)胞的單獨(dú)作用不明顯,而可以促進(jìn)TNF-a介導(dǎo)的細(xì)胞活化。具體的結(jié)果包括:
　　1)IL-17可明顯促進(jìn)TN

7、F-a誘導(dǎo)的多種中性粒細(xì)胞趨化因子(CXCLI、2、5、6、IL-8)及Th17細(xì)胞趨化因子(CCL20)的基因表達(dá),同時(shí)IL-17與TNF-a在P38、ERK和AKT磷酸化水平具有明顯的協(xié)同效應(yīng);
　　2)利用相應(yīng)的激酶抑制劑證實(shí)P38通路是IL-17對TNF-a誘導(dǎo)的IL-8基因表達(dá)發(fā)揮協(xié)同作用的分子機(jī)制;
　　3)利用shRNA建立了Actl低表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系,從基因和蛋白水平均證實(shí)具有明顯的敲低效果。利用Actl敲低

8、細(xì)胞株進(jìn)一步證實(shí)Actl依賴的P38通路是IL-17發(fā)揮促炎作用的重要分子機(jī)制。
　　2.相對于IL-17的促炎作用,IL-17在自身免疫病中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的報(bào)道還非常少,而且機(jī)制遠(yuǎn)不清楚。鑒于我們前期的研究提示IL-17可能通過抑制Thl細(xì)胞的活性發(fā)揮免疫保護(hù)作用,因此本研究重點(diǎn)探討了IL-17在HT-29細(xì)胞是否通過活化不同的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制了Thl細(xì)胞相關(guān)炎癥因子的表達(dá)。本研究的第二部分將按照發(fā)現(xiàn)現(xiàn)象…探討機(jī)制…體內(nèi)

9、驗(yàn)證三步來闡明并回答這些問題。具體的研究內(nèi)容及結(jié)果包括:
　　1)首先通過口服DSS水建立小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型,利用real-time PCR方法檢測小鼠脾臟、腸系膜淋巴結(jié)和結(jié)腸固有層淋巴組織中IL-17和IFN-y的基因表達(dá)水平,結(jié)果表明,無論在外周還是在局部免疫組織DSS腸炎小鼠中均出現(xiàn)IL-17基因表達(dá)水平明顯增加,而IFN-Y水平顯著下降或有下降趨勢,這與我們前期探討免疫調(diào)控分子Tim-3與Th細(xì)胞亞群異常關(guān)系的研究結(jié)果一

10、致(見我們已經(jīng)發(fā)表的文章),提示IL-17在IBD小鼠體內(nèi)可能對Thl細(xì)胞的活性有抑制作用,但其機(jī)制仍不清楚。
　　2)本研究中我們同時(shí)關(guān)注了上述組織中與Thl細(xì)胞趨化和分化相關(guān)的兩種細(xì)胞因子(CXCLII和IL-12)的表達(dá)情況,結(jié)果表明,在DSS腸炎中這兩種細(xì)胞因子的表達(dá)水平均明顯下降。這些結(jié)果進(jìn)一步提示在DSS腸炎中高水平的IL-17可能通過影響Thl細(xì)胞的分化和趨化而抑制Thl細(xì)胞的功能,從而出現(xiàn)IL-17水平升高而IFN

11、-Y水平降低的現(xiàn)象。
　　3)隨后我們以結(jié)腸上皮細(xì)胞系HT-29細(xì)胞作為研究對象,利用real-time PCR方法探討11-17靶向腸上皮細(xì)胞后CXCLlI和IL-12等與Thl細(xì)胞活性相關(guān)的細(xì)胞因子/趨化因子的表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)IL-17能顯著抑制TNF-Q介導(dǎo)的CXCLII和IL-12P35的基因表達(dá),提示IL-17可能通過抑制Thl細(xì)胞的趨化和分化從而負(fù)調(diào)控Thl細(xì)胞功能發(fā)揮抗炎作用。在隨后的機(jī)制研究中我們通過Western

12、Blot、shRNA、表達(dá)譜芯片等技術(shù)探討了IL-17在HT-29細(xì)胞介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)作用(抑制Thl細(xì)胞活性)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　主要的結(jié)果包括:
　?、買L-17能協(xié)同增強(qiáng)TNF-a誘導(dǎo)的ERK-C/EBPp和AKT磷酸化水平,利用相應(yīng)的激酶抑制劑進(jìn)一步證實(shí)這種信號(hào)水平的協(xié)同是IL-17負(fù)調(diào)控CXCLlI和IL-12P35基因表達(dá)的重要分子機(jī)制;
　　②用shRNA敲低Actl表達(dá)后IL-17對TNF-a誘導(dǎo)的

13、ERK和AKT磷酸化水平未見明顯協(xié)同效應(yīng),同時(shí),IL-17不能抑制TNF-a誘導(dǎo)的CXCLII和IL-12P35基因的表達(dá)。這些結(jié)果證實(shí)Actl依賴的ERK和PI3K-AKT通路是IL-17發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用的重要機(jī)制;
　?、劾没蛐酒夹g(shù)對Actl敲低后HT-29細(xì)胞的表達(dá)譜進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)Actl敲低后與PI3K-AKT通路密切相關(guān)的基因PI3K-CG(PI3KIB亞單位)的表達(dá)水平顯著降低,同時(shí)IL-17促進(jìn)PI3K-CG基

14、因表達(dá)的作用也顯著減弱。這些結(jié)果提示IL-17可能通過Actl依賴的方式促進(jìn)PI3K-CG的表達(dá)從而影響PI3KIB-AKT通路的活性。
　　4)最后,為進(jìn)一步證實(shí)IL-17靶向腸上皮細(xì)胞抑制IL-12基因的表達(dá)而負(fù)調(diào)控Thl細(xì)胞的分化,我們模擬體內(nèi)環(huán)境進(jìn)行了HT-29細(xì)胞與PBMC共孵育。結(jié)果表明,IL-17可通過抑制腸上皮細(xì)胞IL-12基因的表達(dá)而負(fù)調(diào)控Thl細(xì)胞的分化及功能。
　　5)為了進(jìn)一步在體內(nèi)驗(yàn)證IL-17是否

15、通過抑制CEC中Thl相關(guān)炎癥介質(zhì)的表達(dá)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用,我們進(jìn)行了如下的實(shí)驗(yàn):
　?、貲SS腸炎小鼠在建模后1、3、5、7天經(jīng)腹腔注射IL-17單克隆抗體,結(jié)果顯示IL-17抗體阻斷后DSS炎癥反應(yīng)明顯加重,同時(shí)腸上皮細(xì)胞中CXCLlI、IL-12P35及IFN-Y的表達(dá)水平均顯著升高,從而表明IL-17抗體阻斷后影響了CEC的功能,增強(qiáng)Thl細(xì)胞活性,從而加重了DSS腸炎;
　?、跒榱诉M(jìn)一步驗(yàn)證CEC在IL-17介導(dǎo)免疫

16、調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵作用,我們將DSS腸炎來源的腸上皮細(xì)胞經(jīng)腹腔注射到DSS模型小鼠體內(nèi)后發(fā)現(xiàn),DSS來源的腸上皮細(xì)胞能明顯加重腸道炎癥反應(yīng),伴隨CXCLII、IL-12P35及IFN-y等炎癥介質(zhì)表達(dá)的升高,而同時(shí)給予重組IL-17蛋白能顯著逆轉(zhuǎn)CEC的上述病理作用。體內(nèi)試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了IL-17-腸上皮細(xì)胞-Thl細(xì)胞軸的免疫調(diào)控機(jī)制。
　　結(jié)論:
　　我們的上述研究較為系統(tǒng)地闡述了IL-17在炎癥性腸病中的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。

17、一方面我們發(fā)現(xiàn)IL-17作用于腸上皮細(xì)胞后能通過Actl依賴的MAPK-p38活化通路穩(wěn)定多種趨化因子的轉(zhuǎn)錄后mRNA,從而促進(jìn)以中性粒細(xì)胞浸潤為主的局部炎癥反應(yīng);另一方面IL-17則又能通過Actl-PI3KIB-AKT和Actl-ERK-C/EBPp兩條相對獨(dú)立的信號(hào)通路抑制TNF-a誘導(dǎo)的CXCLII和IL-12P35基因的表達(dá),從而負(fù)調(diào)控Thl細(xì)胞的功能。本研究通過對IL-17雙向調(diào)控機(jī)制的深入探討,進(jìn)一步解釋了靶向IL-17的