過表達(dá)PDGFR-β的EPCs在損傷血管修復(fù)中作用研究.pdf

1、1.背景與目的：
　　 血管內(nèi)皮損傷是動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)和經(jīng)皮冠脈介入術(shù)(percutaneous coronary intervention，PCI)后血管再狹窄的一個主要的病理生理基礎(chǔ)。因此，內(nèi)皮的修復(fù)和再生成為治療心血管疾病的關(guān)鍵策略。雖然內(nèi)皮細(xì)胞(Endothelial cells，ECs)通常被認(rèn)為只有依靠鄰近成熟ECs才能被修復(fù)和再生。然而，由于ECs屬于終末分化細(xì)胞，增殖能力較低，

2、極大地限制了其在治療上的應(yīng)用。
　　 內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial precusor cells，EPCs)是一種特殊類型的骨髓祖細(xì)胞，是血管ECs的前體細(xì)胞。它能夠進(jìn)入循環(huán)，增殖并分化為ECs，但尚未表達(dá)成熟血管ECs表型，也未形成血管。EPCs是包括了從血管母細(xì)胞到成熟ECs之間多個階段的細(xì)胞。修復(fù)血管內(nèi)皮主要和早期EPCs密切相關(guān)；而晚期EPCs則隨著其增殖能力的增強(qiáng)，在血管生成中發(fā)揮作用。既往的許多基礎(chǔ)和臨床研究已

3、經(jīng)證實(shí)EPCs可以歸巢到血管損傷的部位、分化為ECs，進(jìn)而替代受損傷的內(nèi)皮。因此，EPCs在出生后缺血組織的血管新生、維持正常內(nèi)皮功能和修復(fù)損傷血管內(nèi)皮等方面都發(fā)揮著極其重要的作用。
　　 血小板源生長因子(Platelet-Derived Growth Factor，PDGF)最初從血小板中分離出來。PDGF是由四種不同多肽鏈(PDGF-A，-B，-C，-D)通過二硫鍵連接的五種糖蛋白異構(gòu)體(PDGF-AA，-BB，-AB，-

4、CC，-DD)組成的家族。這五種PDGF二聚體以不同的親和力和PDGFR-α、PDGFR-β、PDGFR-αβ特異性結(jié)合。而作為有著很強(qiáng)的促細(xì)胞分裂增殖能力和趨化作用的PDGF-BB，是唯一能與α、β、αβ三種受體亞單位結(jié)合的因子。事實(shí)上，PDGF-BB或者PDGFR-β和血管增生性疾病，例如AS和PCI后再狹窄的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。有證據(jù)表明，PDGF-BB或PDGFR-β可以促進(jìn)AS病變形成以及PCI后的血管損傷引起的內(nèi)膜增生。并且，

5、在動物模型上也觀察到使用PDGF或PDGFR的特異性阻滯劑能夠抑制動脈內(nèi)膜損傷后新生內(nèi)膜的增生。
　　 以往的研究表明，PDGF-BB和PDGFR-β之間的相互作用對細(xì)胞的增殖和遷移至關(guān)重要。我們注意到，PDGF-BB和PDGFR-β的相互作用可以誘導(dǎo)PDGFR磷酸化和激活磷酸肌醇3激酶(phosphoinositide3-kinase，PI3K)。而PI3K信號通路，也同樣參與許多細(xì)胞進(jìn)程，包括細(xì)胞增殖、存活、運(yùn)動和血管生成。

6、
　　 在損傷血管的ECs再生中，EPCs始終發(fā)揮著重要的作用。而基于PDGF-BB和PDGFR-β的生物學(xué)功能，我們推測PDGF-BB和PDGFR-β可能和EPCs增殖、遷移和血管生成有潛在的聯(lián)系，并且能夠參與新生血管形成和血管損傷后的修復(fù)過程。因此，在本實(shí)驗(yàn)中，我們通過過表達(dá)PDGFR-β評估PDGF-BB在EPCs增殖、遷移和血管新生中所發(fā)揮的作用。此外，我們將過表達(dá)PDGFR-β的EPCs通過靜脈輸注到小鼠體內(nèi)，觀察EP

7、Cs介導(dǎo)的血管內(nèi)皮修復(fù)。我們的研究結(jié)果旨在為血管損傷的治療提供一個新的思路。
　　 2.方法：
　　 2.1.PDGFR-β在脾源性EPCs的表達(dá)
　　 2.1.1.EPCs培養(yǎng)和鑒定
　　 密度梯度離心法獲取小鼠脾臟單個核細(xì)胞(mononuclear cells，MNCs)，在添加20%優(yōu)質(zhì)胎牛血清、VEGF10ng/ml的DMEM/F-12培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)。顯微鏡下觀察細(xì)胞生長、形態(tài)學(xué)變化；acLDL

8、-DiI攝取和UEA-I結(jié)合實(shí)驗(yàn)觀察EPCs是否具有ECs功能特性；利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞表面干細(xì)胞抗原及內(nèi)皮細(xì)胞特異性抗原鑒定。
　　 2.1.2.PDGFR-β在EPCs的定位和表達(dá)
　　 2.1.2.1.免疫熒光檢測PDGFR-β在EPCs的細(xì)胞定位
　　 2.1.2.2.半定量PCR和Western blot檢測PDGFR-β在EPCs的表達(dá)
　　 2.2.基因轉(zhuǎn)染脾源性EPCs
　　 2

9、.2.1.脂質(zhì)體介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染
　　 培養(yǎng)10-11天，融合率在60-70%以上的EPCs，利用LipofectamineTM2000進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。質(zhì)粒DNA與LipofectamineTM2000的比率為1:2。為了觀察質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率，用激光共聚焦顯微鏡觀察EGFP的熒光表達(dá)情況。
　　 2.2.2.計算轉(zhuǎn)染效率
　　 轉(zhuǎn)染效率= EGFP表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)/計數(shù)細(xì)胞總數(shù)。
　　 2.2.3.半定量PCR和

10、Western blot檢測PDGFR-β在EPCs的表達(dá)
　　 2.3.EPCs分泌的PDGF-BB
　　 為了比較未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染了過表達(dá)PDGFR-β質(zhì)粒的EPCs分泌PDGF-BB的濃度，我們將培養(yǎng)上清液用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)進(jìn)行了檢測。
　　 2.4.PDGF-BB對PDGFR-β過表達(dá)EPCs生物學(xué)功能的影響
　　 為了

11、觀察轉(zhuǎn)染外源性PDGFR-β和不同濃度的PDGF-BB刺激對EPCs生物學(xué)功能的影響，三組轉(zhuǎn)染了PDGFR-β的EPCs(對照組、pEGFP-N2組、pEGFP-N2-PDGFR-β組)分別加入不同濃度的PDGF-BB(0、10、20、40、80，或160 ng/ml)。
　　 2.4.1.PDGF-BB對PDGFR-β過表達(dá)EPCs增殖功能的影響
　　 用MTS測定EPCs的增殖變化。
　　 2.4.2.PDG

12、F-BB對PDGFR-β過表達(dá)EPCs遷移功能的影響
　　 用Transwell小室測定EPCs的遷移。
　　 2.4.3.PDGF-BB對PDGFR-β過表達(dá)EPCs血管生成功能的影響
　　 用基質(zhì)膠測定EPCs體外血管生成能力。
　　 2.5.探討PDGFR-β/PI3K/Akt信號通路在PDGF-BB介導(dǎo)的EPCs生物學(xué)功能變化中的作用
　　 為了評價PDGFR-β/PI3K/Akt信號通路

13、是否參與PDGF-BB介導(dǎo)EPCs的生物學(xué)功能，兩組EPCs(對照組、pEGFP-N2-PDGFR-β組)在加入最大有效濃度的PDGF-BB前，分別被給予PDGFR-β酪氨酸磷酸化抑制劑AG1295、PI3K信號通路阻斷劑LY294002和Akt激酶抑制劑sc-221226預(yù)處理1h。
　　 2.5.1.EPCs增殖功能檢測
　　 用MTS測定EPCs的增殖變化。
　　 2.5.2.EPCs遷移功能檢測
　

14、　 用Transwell小室測定EPCs的遷移。
　　 2.5.3.EPCs血管生成功能檢測
　　 用基質(zhì)膠測定EPCs體外血管生成能力。
　　 2.5.4.Western blot檢測PDGFR-β、PI3K和Akt的磷酸化水平
　　 為了觀察PDGFR-β/PI3K/Akt信號通路是否參與調(diào)控EPCs，在給予PDGF-BB刺激和AG1295、LY294002、sc-221226預(yù)處理后，通過West

15、ern blot分別檢測PDGFR-β、PI3K和Akt的磷酸化水平。
　　 2.6.PDGFR-β過表達(dá)EPCs在血管損傷修復(fù)過程中的作用
　　 2.6.1.建立小鼠頸動脈損傷模型
　　 2.6.2.PDGF-BB在被損傷血管上的定位和表達(dá)
　　 2.6.2.1.免疫熒光檢測PDGF-BB在被損傷血管上的定位
　　 2.6.2.2.實(shí)時定量PCR和Western blot檢測PDGF-BB在被損

16、傷血管上的表達(dá)
　　 2.6.3.脾源性EPCs移植
　　 小鼠行脾臟切除術(shù)后，再行頸動脈損傷。小鼠頸動脈損傷后，通過尾靜脈注射EGFP-EPCs或者PDGFR-β-EPCs。24h后再重復(fù)注射一次。
　　 2.6.4.EPCs示蹤
　　 用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞是否歸巢到血管損傷的局部，以及是否具有ECs表型。
　　 2.6.5.EPCs移植對血管再內(nèi)皮化的影響
　　 為了評估血管再內(nèi)

17、皮化，在損傷后的第7d獲取損傷側(cè)頸總動脈，冰凍切片后進(jìn)行Evans blue染色。
　　 2.6.6.EPCs移植對血管新生內(nèi)膜增厚的影響
　　 為了評估血管新生內(nèi)膜厚度，在損傷后的第14d獲取損傷側(cè)頸總動脈冰凍切片，進(jìn)行HE染色。
　　 2.6.7.PDGFR-β過表達(dá)EPCs對損傷后血管內(nèi)膜細(xì)胞凋亡的影響
　　 為了檢測血管內(nèi)膜細(xì)胞凋亡，在損傷后的第7d獲取損傷側(cè)頸總動脈，冰凍切片后進(jìn)行TUNEL免疫

18、熒光染色。TUNEL的凋亡指數(shù)=標(biāo)記陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)。
　　 3.結(jié)果：
　　 3.1.PDGFR-β在脾源性EPCs的表達(dá)
　　 3.1.1.EPCs鑒定
　　 3.1.1.1.EPCs的形態(tài)學(xué)特征
　　 倒置顯微鏡觀察可見：小鼠脾源性EPCs培養(yǎng)4-7d，呈梭形、紡錘形，具有內(nèi)皮樣細(xì)胞形態(tài)。同時有細(xì)胞集落形成；10d可見細(xì)胞首尾相連，呈線狀排列；20d可見細(xì)胞相互融合，呈鋪路石狀。

19、　　 3.1.1.2.熒光雙染鑒定
　　 培養(yǎng)4-7d的EPCs，用acLDL-DiI和FITC-UEA-I進(jìn)行染色。激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞攝取acLDL-DiI呈現(xiàn)紅色熒光，結(jié)合FITC-UEA-I呈現(xiàn)綠色熒光，acLDL-DiI和FITC-UEA-I雙染色陽性細(xì)胞呈現(xiàn)黃色熒光，即為雙染陽性細(xì)胞。這些雙染的細(xì)胞被認(rèn)為是正在分化的EPCs。我們實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)的EPCs雙染陽性細(xì)胞數(shù)為91.2±1.8%。
　　 3

20、.1.1.3.分子表面標(biāo)記表達(dá)鑒定
　　 利用流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測培養(yǎng)7d的EPCs，貼壁細(xì)胞表面表達(dá)干細(xì)胞抗原Sca-1為71.7±0.93%；表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞特異性抗原VEGFR-2為52.49±9.27%。
　　 3.1.2.PDGFR-β在EPCs的定位和表達(dá)
　　 3.1.2.1.免疫熒光檢測PDGFR-β在EPCs的細(xì)胞定位
　　 培養(yǎng)7d的EPCs，通過免疫熒光技術(shù)在激光共聚焦顯微鏡下檢測可見：

21、PDGFR-β在培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞膜上陽性表達(dá)率為88.6±4.3%，說明PDGFR-β主要定位在EPCs的細(xì)胞膜。
　　 3.1.2.2.半定量PCR和Western blot檢測PDGFR-β表達(dá)
　　 培養(yǎng)4、7、14、21d的EPCs，通過半定量RT-PCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)在EPCs有PDGFR-β mRNA和蛋白的表達(dá)。而且，隨著EPCs分化時間的延長，PDGFR-β mRNA和蛋白的表達(dá)逐漸增加

22、，但表達(dá)量均呈較低水平。
　　 3.2.基因轉(zhuǎn)染脾源性EPCs
　　 3.2.1.通過激光共聚焦顯微鏡觀察：在轉(zhuǎn)染后21h，可以看見被轉(zhuǎn)染的EPCs有EGFP熒光表達(dá)；而未被轉(zhuǎn)染的正常EPCs則沒有EGFP的熒光表達(dá)。
　　 3.2.2.計算轉(zhuǎn)染效率大概在50-60%。
　　 3.2.3.在轉(zhuǎn)染后72h，半定量RT-PCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)與空白對照組和pEGFP-N2空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比較，

23、pEGFP-N2-PDGFR-β質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組PDGFR-β mRNA和蛋白在EPCs的表達(dá)顯著增高(P<0.01)。
　　 3.3.EPCs分泌的PDGF-BB
　　 PDGF-BB是一種分泌蛋白，在EPCs的培養(yǎng)液上清中，它的濃度是17.2±2.0 pg/ml。在轉(zhuǎn)染后48 h和72h，與空白對照組和pEGFP-N2空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比較，pEGFP-N2-PDGFR-β組EPCs分泌的PDGF-BB濃度顯著降低(P<0.0

24、1)。
　　 3.4.PDGF-BB對PDGFR-β過表達(dá)EPCs生物學(xué)功能的影響
　　 3.4.1.PDGF-BB對PDGFR-β過表達(dá)EPCs增殖功能的影響
　　 PDGF-BB能夠顯著促進(jìn)EPCs的增殖。在對照組和空白質(zhì)粒組，其最大效應(yīng)發(fā)生在20 ng/ml；在過表達(dá)PDGFR-β組，其最大效應(yīng)發(fā)生在80 ng/ml。
　　 3.4.2.PDGF-BB對PDGFR-β過表達(dá)EPCs遷移功能的影響

25、r>　　 PDGF-BB能夠顯著促進(jìn)EPCs的遷移。在對照組和空白質(zhì)粒組，其最大效應(yīng)發(fā)生在20 ng/ml：在過表達(dá)PDGFR-β組，其最大效應(yīng)發(fā)生在80 ng/ml。
　　 3.4.3.PDGF-BB對PDGFR-β過表達(dá)EPCs血管生成功能的影響
　　 PDGF-BB能夠顯著促進(jìn)EPCs的血管新生。在對照組和空白質(zhì)粒組，其最大效應(yīng)發(fā)生在20 ng/ml；在過表達(dá)PDGFR-β組，其最大效應(yīng)發(fā)生在80 ng/ml。<

26、br>　　 3.5.PI3K/Akt信號通路在PDGF-BB介導(dǎo)的EPCs生物學(xué)功能變化中的作用
　　 3.5.1.EPCs增殖能力檢測
　　 經(jīng)過AG1295、LY294002，或sc-221226預(yù)處理，PDGF-BB誘導(dǎo)EPCs增殖無論是在對照組(PDGF-BB20 ng/ml)還是在過表達(dá)PDGFR-β組(PDGF-BB80 ng/ml)均被顯著抑制。結(jié)果表明，PI3K/Akt信號通路參與了PDGF-BB誘導(dǎo)的

27、EPCs增殖。
　　 3.5.2.EPCs遷移功能檢測
　　 經(jīng)過AG1295、LY294002，或sc-221226預(yù)處理，PDGF-BB誘導(dǎo)的EPCs遷移無論是在對照組(PDGF-BB20 ng/ml)還是在過表達(dá)PDGFR-β組(PDGF-BB80 ng/ml)均被顯著抑制。結(jié)果表明，PI3K/Akt信號通路參與了PDGF-BB誘導(dǎo)EPCs遷移。
　　 3.5.3.EPCs血管生成功能檢測
　　 經(jīng)

28、過AG1295、LY294002，或sc-221226預(yù)處理，PDGF-BB誘導(dǎo)EPCs管型生成無論是在對照組(PDGF-BB20 ng/ml)還是在過表達(dá)PDGFR-β組(PDGF-BB80 ng/ml)均被顯著抑制。結(jié)果表明，PI3K/Akt信號通路參與了PDGF-BB誘導(dǎo)EPCs血管生成。
　　 3.5.4.Western blot檢測PDGFR-β、PI3K和Akt的磷酸化水平
　　 經(jīng)過AG1295、LY294

29、002，或sc-221226預(yù)處理后，PDGF-BB誘導(dǎo)EPCs的PDGFR-β、PI3K和Akt磷酸化蛋白活化水平減弱。
　　 3.6.PDGFR-β過表達(dá)EPCs在血管損傷修復(fù)過程中的作用
　　 3.6.1.小鼠頸動脈損傷模型的建立
　　 小鼠頸動脈損傷模型成功建立。HE染色證實(shí)：在頸動脈損傷后7d，鏡下出現(xiàn)可見的內(nèi)膜增生；在頸動脈損傷后28d，新生內(nèi)膜明顯增生。
　　 3.6.2.PDGF-BB在被

30、損傷的血管上的定位和表達(dá)
　　 3.6.2.1.免疫熒光檢測PDGF-BB在被損傷血管上的定位
　　 通過免疫熒光技術(shù)在激光共聚焦顯微鏡下檢測可見：在被損傷血管局部的內(nèi)膜和中膜，有PDGF-BB表達(dá)。但是在正常血管則很少有PDGF-BB表達(dá)。
　　 3.6.2.2.實(shí)時定量PCR和Western blot檢測PDGF-BB在被損傷血管上的表達(dá)
　　 PDGF-BB mRNA和蛋白在正常血管組織低表達(dá)；血管

31、損傷后4d內(nèi)表達(dá)變化不顯著；7d表達(dá)迅速上升達(dá)到高峰：之后逐漸下降，損傷后第21d基本恢復(fù)正常水平。
　　 3.6.3.EPCs示蹤
　　 EPCs移植后24h，通過激光共聚焦熒光顯微鏡可以在損傷血管局部觀察到攜帶綠色熒光的EGFP細(xì)胞。移植后10d，損傷血管部位可見vWF染色陽性，提示EPCs可歸巢于損傷血管部位，分化為ECs，直接參與損傷血管內(nèi)皮的修復(fù)。
　　 3.6.4.PDGFR-β過表達(dá)EPCs對損傷后

32、血管再內(nèi)皮化的影響
　　 通過Evans blue染色觀察發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)對照組內(nèi)皮無損傷，內(nèi)皮覆蓋率為100%，而損傷組殘留內(nèi)皮覆蓋率為0%，說明內(nèi)皮剝脫完全。PDGFR-β過表達(dá)EPCs明顯促進(jìn)第7d損傷血管的再內(nèi)皮化，與相同時間點(diǎn)EGFP-EPCs移植組比較有顯著差異(P<0.05)，說明PDGFR-β過表達(dá)EPCs對損傷血管早期的再內(nèi)皮化有促進(jìn)作用。
　　 3.6.5.PDGFR-β過表達(dá)EPCs對損傷后血管內(nèi)膜增生

33、的影響
　　 在血管損傷后第14 d，PDGFR-β過表達(dá)EPCs移植組血管組織內(nèi)、中膜比值明顯低于EGFP-EPCs移植組的內(nèi)、中膜比值(P<0.05)。說明過表達(dá)PDGFR-β EPCs抑制了小鼠頸動脈損傷后血管新生內(nèi)膜的增厚。
　　 3.6.6.PDGFR-β過表達(dá)EPCs對損傷后血管中膜細(xì)胞凋亡的影響
　　 在血管損傷后第7d，PDGFR-β過表達(dá)EPCs移植組中膜細(xì)胞TUNEL凋亡指數(shù)明顯大于EGFP-

34、EPCs移植組(p<0.01)。說明PDGFR-β過表達(dá)EPCs對損傷血管早期的中膜細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用。
　　 4.結(jié)論：
　　 4.1.小鼠脾臟中含有EPCs，在一定培養(yǎng)條件下可向內(nèi)皮樣細(xì)胞分化；
　　 4.2.PDGFR-β在小鼠脾源性EPCs呈低表達(dá)，主要定位于細(xì)胞膜；
　　 4.3.PDGF-BB可促進(jìn)EPCs的增殖、遷移和血管生成；
　　 4.4.過表達(dá)PDGFR-β通過PI3 K/Ak