Notch信號(hào)在牙髓損傷修復(fù)中的作用研究.pdf

1、牙齒發(fā)生和牙髓損傷修復(fù)均受到眾多信號(hào)分子的精密調(diào)控。前期研究表明，Notch信號(hào)通路在進(jìn)化上高度保守，它可以通過局部細(xì)胞間相互作用傳導(dǎo)信號(hào)，調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等多種生命過程，最終決定多細(xì)胞動(dòng)物發(fā)育過程中多種細(xì)胞的命運(yùn)。本研究擬從體外、體內(nèi)兩方面進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。首先利用致齲菌的毒力因子脂多糖LPS刺激小鼠成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞系MDPC-23，從而探討成牙本質(zhì)細(xì)胞在受到外界致齲菌毒力因子刺激下其Notch相關(guān)基因的表達(dá)情況。接著，通過構(gòu)建大

2、鼠牙髓炎模型，從而探討Notch受體在牙髓損傷修復(fù)過程中的動(dòng)態(tài)表達(dá)模式。最后，我們通過抑制Notch信號(hào)繼而探討其對(duì)成牙本質(zhì)樣細(xì)胞分化的影響。
　　所取得的研究結(jié)果如下：
　　1.牙髓損傷細(xì)胞模型建立及NOTCH信號(hào)表達(dá)檢測(cè)
　　1)牙髓損傷細(xì)胞模型的建立
　　利用不同濃度的LPS刺激MDPC-23細(xì)胞系，并進(jìn)行MTT檢測(cè)。結(jié)果表明，當(dāng)LPS濃度超過1μg/ml且對(duì)MDPC-23細(xì)胞作用72h時(shí)，表現(xiàn)為毒性作用。

3、24h后，各濃度LPS對(duì)細(xì)胞增殖有明顯促進(jìn)作用（P<0.05）。48h后，10ng/ml～1μg/ml組與對(duì)照組相比沒有明顯區(qū)別（P>0.05），5μg/ml組對(duì)細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用（P<0.05）。72h后，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)細(xì)胞增殖均為抑制作用，其中1μg/ml和5μg/ml組抑制作用顯著（P<0.05）。通過對(duì)細(xì)胞增殖活力的檢測(cè)，初步確定了合適的LPS濃度，為進(jìn)一步的研究打下了基礎(chǔ)。
　　2)LPS刺激對(duì)MDPC-23細(xì)胞中N

4、otch信號(hào)相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　利用合適濃度的LPS刺激MDPC-23細(xì)胞系，進(jìn)行Real-timePCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，在對(duì)照組中，Notch1表達(dá)平穩(wěn)并呈輕微上升趨勢(shì)，當(dāng)用10ng/ml～1μg/ml的LPS作用后，Notch1的表達(dá)先升高，而后逐漸下降。Jagged1和Delta1在對(duì)照組中均表現(xiàn)出下降趨勢(shì)；Jagged1加入100ng/ml～1μg/mlLPS后，1～3d表達(dá)為上升趨勢(shì)，3～5d表達(dá)為下降趨勢(shì)；Delt

5、a1在加入10ng/ml～1μg/ml的LPS后表現(xiàn)為0～3d表達(dá)逐漸下降，3～5d逐漸上升。Hes1在對(duì)照組中表達(dá)先輕微上升而后基本平穩(wěn)；當(dāng)加入10ng/m和100ng/ml的LPS后，0～5d表達(dá)逐漸升高；當(dāng)加入1μg/ml的LPS時(shí)，0～1d表達(dá)逐漸升高，而1～5d逐漸下降。通過對(duì)Notch相關(guān)基因表達(dá)量的研究，探討在牙髓損傷修復(fù)中各基因的動(dòng)態(tài)變化，我們得出結(jié)論，一定濃度LPS刺激可使MDPC-23中Notch信號(hào)分子表達(dá)升高，N

6、otch信號(hào)通路在維系細(xì)胞功能平衡、啟動(dòng)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)有重要意義。
　　2.Notch受體在牙髓損傷動(dòng)物模型中的動(dòng)態(tài)表達(dá)分析
　　通過構(gòu)建大鼠實(shí)驗(yàn)性牙髓炎模型，我們探討了Notch2的表達(dá)情況，牙髓損傷早期（3d），牙髓細(xì)胞中Notch2呈弱陽性表達(dá)，成牙本質(zhì)細(xì)胞陰性表達(dá)。牙髓損傷中期（5d），成牙本質(zhì)細(xì)胞深層細(xì)胞Notch2陽性表達(dá)達(dá)到高峰。牙髓損傷晚期（7d），Notch2在牙髓細(xì)胞中表達(dá)減弱，而在成牙本質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)高峰。

7、牙髓損傷末期（14d），Notch2僅在成牙本質(zhì)細(xì)胞下層細(xì)胞中尚有微弱表達(dá)，而其余牙髓細(xì)胞均為陰性表達(dá)。而對(duì)于LPS刺激組，3d～7d內(nèi)Notch2染色程度均明顯高于單純機(jī)械損傷組。對(duì)照組正常牙髓組織Notch2表達(dá)為陰性。通過體內(nèi)試驗(yàn)我們得出，機(jī)械損傷可以誘導(dǎo)Notch2在牙髓間充質(zhì)細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，同時(shí)LPS的刺激作用可以加劇應(yīng)激反應(yīng)并提高Notch2的表達(dá)水平。Notch信號(hào)對(duì)牙髓損傷修復(fù)起到了重要作用。
　　3.抑

8、制Notch信號(hào)對(duì)小鼠牙乳頭細(xì)胞系MDPC-23分化潛能影響的初步分析。
　　為了進(jìn)一步說明Notch信號(hào)對(duì)牙乳頭細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化中起到的作用，我們對(duì)小鼠牙乳頭細(xì)胞系MDPC-23進(jìn)行礦化誘導(dǎo)，并向誘導(dǎo)液中加入不同濃度的Notch信號(hào)抑制劑DAPT，從而觀察在Notch信號(hào)被抑制的條件下MDPC-23細(xì)胞的堿性磷酸酶表達(dá)變化以及形成礦化結(jié)節(jié)的改變。結(jié)果顯示，DAPT抑制Notch信號(hào)后，MDPC-23細(xì)胞的ALP活性及礦化結(jié)

9、節(jié)形成能力均有所降低。這些結(jié)果提示，Notch信號(hào)的存在可能有助于促進(jìn)MDPC-23細(xì)胞分化。
　　綜上所述，牙齒發(fā)育中細(xì)胞的多樣性是以Notch信號(hào)所介導(dǎo)的旁側(cè)分化為基礎(chǔ)的，當(dāng)成牙本質(zhì)細(xì)胞在牙髓受到損傷時(shí)發(fā)生凋亡，此時(shí)牙髓間充質(zhì)細(xì)胞就會(huì)開始啟動(dòng)自我分化并逐漸形成新生的成牙本質(zhì)樣細(xì)胞，繼而分泌形成修復(fù)性牙本質(zhì)。Notch信號(hào)通路可以在牙髓損傷修復(fù)動(dòng)態(tài)過程中激活表達(dá)，體現(xiàn)了一種在組織修復(fù)過程早期的分子反應(yīng)機(jī)制。本研究認(rèn)為，在體外細(xì)胞

10、實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Notch受體以及配體Jagged1對(duì)細(xì)胞分化具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用，而配體Delta1則對(duì)細(xì)胞分化具有正向調(diào)節(jié)作用。同時(shí)，抑制Notch信號(hào)可以降低MDPC-23細(xì)胞的礦化形成能力，即抑制了其向成牙本質(zhì)樣細(xì)胞分化的能力。體內(nèi)研究中發(fā)現(xiàn)，牙髓受到刺激后，Notch的表達(dá)強(qiáng)度呈現(xiàn)出隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化，體現(xiàn)了Notch首先對(duì)外界急性刺激的一個(gè)應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生對(duì)成牙本質(zhì)細(xì)胞的一個(gè)保護(hù)性的抑制凋亡的作用。本研究認(rèn)為，Notch信號(hào)的再激活對(duì)于平