血管損傷修復(fù)中CCN1對EPCs功能的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、1.背景與目的 血管內(nèi)皮損傷是經(jīng)皮冠脈介入術(shù)( percutaneous coronary intervention，PCI)血管再狹窄及支架內(nèi)血栓形成的核心[1]，也是動脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病等多種血管性疾病共同的病理生理基礎(chǔ)[2-4]。內(nèi)皮的有效再生是抑制血管平滑肌的異常增生和防止血栓形成的關(guān)鍵[5]。因此，盡早促進(jìn)受損血管再內(nèi)皮化、恢復(fù)內(nèi)皮功能，儼然是抑制血管損傷不良修復(fù)，預(yù)防或防治血管再狹窄及血栓形成的有效策略。傳統(tǒng)

2、觀念認(rèn)為內(nèi)皮損傷的修復(fù)僅僅依靠鄰近內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖。近年的大量研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是機(jī)體促進(jìn)內(nèi)皮有效再生以及血管良性修復(fù)的重要內(nèi)在機(jī)制[6-9]?，F(xiàn)已證明，EPCs在體內(nèi)微環(huán)境的作用下能夠分化成有功能的內(nèi)皮細(xì)胞，參與缺血組織的血管新生并整合到損傷血管壁的新生內(nèi)膜中參與損傷血管的再內(nèi)皮化[10-13]。然而，目前對于調(diào)控EPCs增殖、遷移和分化的機(jī)制及某些關(guān)鍵因子在其

3、中的作用尚不完全清楚。 CCN1是近年發(fā)現(xiàn)的一種分泌型基質(zhì)信號蛋白[14]，廣泛參與分化、發(fā)育、腫瘤生長等多種病理生理過程的調(diào)控[15-18]。已有研究表明：1)胚胎發(fā)育過程中CCN1基因缺陷將導(dǎo)致胎盤血管生成減少以及分支障礙，引起胚胎死亡[21]。2)成年后CCN1的表達(dá)與血管性疾病如動脈粥樣硬化、原發(fā)性高血壓、腫瘤血管新生等密切相關(guān)[22-25]；CCNI還參與了皮膚、骨骼、肝臟等多種組織的再生修復(fù)過程[26-28]。3)

4、在體外，CCN1能促進(jìn)大鼠角膜及兔股動脈缺血后的血管新生，并對血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及管樣形成能力均有促進(jìn)作用[29-33]。4)CCN1在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的增殖、分化、遷移中發(fā)揮重要調(diào)控作用，并誘導(dǎo)CD34+細(xì)胞的遷移和歸巢[33-35]。提示：CCN1可能在EPCs介導(dǎo)的血管新生及血管損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。 因此在本課題中，我們將從整體動物和和細(xì)胞水平探討CCN1在EPCs增殖、遷移、分化以及血管損傷修復(fù)中的

5、作用及其機(jī)制。期望為深入認(rèn)識CCN1的生物學(xué)功能及EPCs的調(diào)控機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為進(jìn)一步促進(jìn)血管損傷后內(nèi)皮再生、血管良性修復(fù)提供新的思路和策略。 2.方法 2.1重組腺病毒Ad-CCNl和Ad-Id1的構(gòu)建 從大鼠組織提取RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增得到目的基因CCN1和Id1片段，通過pMD19T-Simple和AdEasy細(xì)菌內(nèi)同源重組系統(tǒng)構(gòu)建CCN1和Idl的病毒過表達(dá)載體，分別命名為Ad-CCN1和A

6、d-Id1，經(jīng)過測序、PCR和酶切鑒定重組病毒Ad-CCN1和Ad-Id1的構(gòu)建。 2.2觀察CCN1在血管損傷修復(fù)過程中的表達(dá)及作用 用1-2月齡的雄性SD大鼠復(fù)制頸動脈球囊損傷模型，通過熒光定量RT-PCR以及Western blot分別觀察CCN1在血管損傷修復(fù)過程中mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化：然后向損傷血管組織轉(zhuǎn)染Ad-CCN1，觀察過表達(dá)CCN1對損傷后4、7、14、21天血管再內(nèi)皮化以及新生內(nèi)膜增厚的影響。

7、 2.3 CCN1對EPCs增殖、遷移和分化的作用 通過密度梯度離心及選擇性培養(yǎng)的方法在體外分離、培養(yǎng)大鼠骨髓源EPCs，經(jīng)過細(xì)胞形態(tài)學(xué)、表面分子標(biāo)志以及Dil-acLDL/FITC-UEA-I雙陽性鑒定后，轉(zhuǎn)染Ad-CCNl以及含CCNl shRNA的重組質(zhì)粒pGenesil-CCNl.以觀察過表達(dá)或沉默CCN1基因?qū)PCs增殖、遷移、分化的作用。 2.4探討CCN1作用于EPCs增殖、遷移和分化的分子機(jī)制

8、 2.4.1利用GEArray公司的DNA芯片初步分析Ad-CCNl作用后48小時對EPCs基因表達(dá)的影響，篩選CCN1作用的可能下游靶點(diǎn)； 2.4.2檢測Ad-CCN1作用下負(fù)性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Id1在轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)水平的變化，并通過Ad-Id1與Ad-CCN1的共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)觀察Id1對Ad-CCN1誘導(dǎo)的EPCs分化的影響，以明確Id1是否參與介導(dǎo)Ad-CCNl對EPCs分化的調(diào)控作用。 3.結(jié)論 3.1 C

9、CN1在球囊損傷的大鼠頸動脈組織動態(tài)高表達(dá)；過表達(dá)CCN1顯著促進(jìn)大鼠球囊損傷早期血管再內(nèi)皮化程度；過表達(dá)CCN1抑制大鼠球囊損傷第14天血管新生內(nèi)膜的增厚； 3.2過表達(dá)CCN1基因促進(jìn)EPCs的遷移和分化；沉默CCN1基因抑制EPCs的增殖、遷移和分化； 3.3過表達(dá)CCN1誘導(dǎo)EPCs中20個基因表達(dá)的顯著變化； 3.4過表達(dá)CCN1抑制Idl在EPCs的表達(dá)；Id1至少部分抑制CCN1對EPCs分化的促進(jìn)