飲酒對腦血管功能與結(jié)構(gòu)的影響及損傷機制.pdf

1、乙醇(ethanol，EtOH)又名酒精，是各種酒類飲品中主要的有效成分。本課題擬從飲酒后腦血管功能及結(jié)構(gòu)異常為切入點，從以下三個方面研究乙醇的血管毒性作用及機制:(1)建立慢性飲酒大鼠模型，觀察其腦血管功能及結(jié)構(gòu)變化;(2)觀察乙醇及代謝產(chǎn)物乙醛對血管內(nèi)皮細胞及血管平滑肌細胞的毒性作用;(3)探討氧化應激機制在乙醇及其代謝產(chǎn)物乙醛對血管內(nèi)皮細胞及血管平滑肌細胞毒性中的作用。通過上述研究，探討飲酒后輕度外力打擊導致tSAH死亡的機制，為

2、此類案件法醫(yī)鑒定提供新的理論依據(jù)。
　　第一部分 飲酒對大鼠腦動脈功能及結(jié)構(gòu)的影響
　　目的:
　　過量飲酒可導致腦血管灌注壓增加、腦血管擴張和血管通透性增加，使腦血管自穩(wěn)態(tài)平衡破壞，并損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)。本部分研究擬通過制備慢性飲酒動物模型，觀察腦基底動脈環(huán)舒縮功能及腦血管結(jié)構(gòu)的變化，從動物整體水平明確飲酒對腦動脈功能與結(jié)構(gòu)的影響，闡明飲酒的血管損傷靶點。
　　方法:
　　1.采用劑量遞增自由飲酒模式(20

3、％v/v酒-水溶液)持續(xù)飲酒12月，建立長期飲酒大鼠模型，并記錄大鼠一般情況及體重的變化;
　　2.采用HE染色、Masson三色染色法和硫堇染色分別觀察慢性飲酒大鼠腦血管和神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變;
　　3.采用微血管張力儀檢測長期飲酒大鼠腦基底動脈環(huán)乙酰膽堿(ACh)誘導的內(nèi)皮依賴性和硝普鈉(SNP)誘導的非內(nèi)皮依賴性舒張反應的變化，以及血管緊張素(AngⅡ)、內(nèi)皮素(ET-1)誘導收縮反應的變化，明確飲酒對血管舒縮功能的影

4、響及其損傷靶點;
　　4.采用放射性免疫分析方法，檢測長期飲酒大鼠血液中內(nèi)皮素和血管緊張素水平的變化;
　　5.采用DHE染色法檢測腦血管環(huán)活性氧，并采用免疫熒光染色及Western blot方法檢測氧化應激相關(guān)蛋白在腦血管環(huán)中的表達變化，以探討氧化應激在飲酒造成腦動脈功能與結(jié)構(gòu)改變中的作用。
　　結(jié)果:
　　1.慢性飲酒大鼠體重顯著降低，倦怠少動，反應遲鈍，毛發(fā)干澀;
　　2.慢性飲酒大鼠腦內(nèi)小動脈及基底

5、動脈血管管壁增粗，管腔變窄，壁/腔比明顯增大，膠原成分增多，并可見海馬神經(jīng)元發(fā)生變性、壞死。
　　3.慢性飲酒大鼠腦基底動脈對ACh誘導的內(nèi)皮依賴性舒張反應下降，SNP誘導的非內(nèi)皮依賴性舒張反應無明顯變化;0.1μMAngⅡ誘導的收縮反應性增強，而ET-1誘導的收縮反應無明顯變化。
　　4.慢性飲酒大鼠血漿中腎素活性(PRA)和血管緊張素Ⅱ水平升高，內(nèi)皮素-1含量無明顯變化。
　　5.慢性飲酒大鼠腦基底動脈環(huán)ROS及N

6、OX亞基p47 phox蛋白表達升高。
　　小結(jié):
　　本部分實驗成功建立了慢性飲酒大鼠模型，并證實了長期大量飲酒可導致大鼠腦動脈重構(gòu)，腦血管功能紊亂，并以內(nèi)皮依賴性舒張功能下降為著。長期飲酒后腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活，ROS水平表達升高，提示持久的氧化應激造成內(nèi)皮細胞的損傷是長期飲酒導致腦血管穩(wěn)態(tài)失衡的重要因素之一。
　　第二部分 乙醇和乙醛對血管內(nèi)皮細胞的毒性作用及機制
　　目的:
　　采用人臍

7、靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilicalvein endothelial cell，HUVEC)，從細胞水平觀察乙醇和乙醛對血管內(nèi)皮細胞的毒性作用及細胞死亡機制，并探討氧化應激在其致?lián)p傷過程中的作用。
　　方法:
　　1.給予HUVEC細胞不同濃度、不同時間的乙醇和乙醛刺激，采用MTT檢測HUVEC細胞生存率，觀察乙醇、乙醛對HUVEC的細胞毒作用;
　　2.采用流式細胞術(shù)檢測乙醇和乙醛處理后HUVCE細胞凋亡情況

8、，明確乙醇、乙醛誘導HUVCE細胞死亡的方式;
　　3.采用透射電鏡觀察乙醇和乙醛處理對HUVCE細胞超微結(jié)構(gòu)的影響;
　　4.采用共聚焦顯微鏡和Western blot方法觀察乙醇和乙醛對HUVEC細胞微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)表達的影響，明確乙醇和乙醛誘導HUVEC細胞死亡的自噬機制;
　　5.采用Western blot方法檢測乙醛對HUVEC細胞PI3K-AKT-mTOR和RAS-MEK-ERK通路中相關(guān)蛋

9、白的表達變化，并使用ERK抑制劑PD98059預處理細胞，以闡明乙醛誘導HUVEC細胞發(fā)生自噬的信號機制;
　　6.采用特異ROS探針標記和熒光顯微鏡觀察乙醇和乙醛處理后氧化應激產(chǎn)物的變化;并采用外源性過氧化氫(H2O2)和非特異性內(nèi)源性ROS清除劑N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)預處理細胞，以明確乙醛是否可通過激活ROS-ERK通路誘導HUVCE細胞發(fā)生自噬。
　　結(jié)果:
　　

10、1.乙醇和乙醛均使HUVEC細胞生存率呈時間、劑量依賴性下降，并且乙醛的毒性作用比乙醇更快、更強;
　　2.流式細胞術(shù)及透射電鏡結(jié)果顯示，乙醇(200mM)處理HUVEC細胞24h和48h，可見細胞發(fā)生早期凋亡，這些凋亡細胞的細胞核形態(tài)不規(guī)則，核染色質(zhì)電子密度增高、邊集呈半月狀。乙醛(20μM)處理HUVEC細胞6h，細胞即發(fā)生非凋亡性細胞死亡。HUVEC細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)較多雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體;
　　3.乙醛處理HUVEC細胞

11、后，細胞骨架排列紊亂，胞體縮小，自噬標記性蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值呈現(xiàn)時間及劑量依賴性升高，而給予不同劑量的乙醇處理HUVEC細胞不同時間后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值無明顯變化;
　　4.乙醛處理HUVEC細胞后，磷酸化ERK呈現(xiàn)時間依賴性表達升高，而pAKT/AKT、pmTOR/mTOR表達均無明顯變化，給予ERK抑制劑PD98059預處理細胞后，可部分翻轉(zhuǎn)乙醛誘導的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高;
　　5.乙醇和乙

12、醛處理誘導的ROS增高呈現(xiàn)一過性，乙醇處理30min后ROS達頂峰，隨后逐漸下降;乙醛誘導的ROS增高出現(xiàn)更早、幅度更高、持續(xù)時間更長，20min時ROS達峰值，50min后仍高于對照組;
　　6.給予外源性H2O2處理HUVEC細胞，可使磷酸化ERK表達和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著增加，給予非特異性內(nèi)源性ROS清除劑NAC則可部分逆轉(zhuǎn)乙醛誘導的磷酸化ERK水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高。
　　小結(jié):
　　過

13、量、持久的乙醇刺激可誘導HUVEC細胞發(fā)生凋亡;而乙醛則可以通過誘導HUVEC細胞產(chǎn)生大量的ROS，從而激活RAS-MEK-ERK通路快速誘導HUVEC細胞發(fā)生自噬，參與細胞損傷過程，而經(jīng)典的PI3K-AKT-mTOR通路在此過程中無明顯作用。
　　第三部分 過量乙醇對人腦血管平滑肌細胞的毒性作用機制
　　目的:
　　血管平滑肌細胞作為血管壁的主要細胞成分之一，在決定血管活性和血管結(jié)構(gòu)中具有重要意義。本部分研究采用人腦

14、血管平滑肌細胞(humanbrain vascular smooth cell，HBVSMC)，從細胞水平觀察乙醇對腦血管平滑肌細胞的毒性作用及其對細胞骨架結(jié)構(gòu)的影響。
　　方法:
　　1.給予不同濃度的乙醇處理HBVSMC細胞，采用MTT法檢測HBVSMC細胞生存率，以觀察乙醇對HBVSMC的細胞毒作用;
　　2.利用流式細胞術(shù)和TUNEL法檢測乙醇處理后HBVSMC細胞凋亡情況，明確乙醇誘導HBVSMC細胞死亡的方

15、式;
　　3.觀察乙醇處理后HBVSMC細胞的形態(tài)變化，并用鬼筆環(huán)肽特異性標記F-actin，Dnase標記G-actin，通過共聚焦顯微鏡觀察不同時間、不同劑量乙醇對HBVSMC細胞骨架結(jié)構(gòu)的影響;
　　4.提取細胞總蛋白，并分步提取HBVSMC細胞F-actin和G-actin蛋白，Weston blot方法觀察HBVSMC細胞F-actin/G-actin比值、細胞收縮表型相關(guān)蛋白SM22α、絲切蛋白Cofilin及細

16、胞縫隙連接蛋白Cx43表達的變化，進一步明確乙醇對HBVSMC細胞骨架結(jié)構(gòu)的影響;
　　5.采用特異ROS探針標記和熒光顯微鏡觀察乙醇處理后HBVSMC細胞氧化應激產(chǎn)物的變化。
　　結(jié)果:過量、持久乙醇作用可誘導HBVSMC細胞發(fā)生凋亡，并使Cx43和Cofilin表達異常，但是細胞骨架整體結(jié)構(gòu)未見明顯改變，且SM22α表達水平及F-actin/G-actin比值無明顯變化。另外，乙醇處理可能通過誘導HBVSMC細胞一過性R

17、OS的產(chǎn)生，繼而參與其凋亡過程。
　　結(jié)論:
　　1.長期大量飲酒可導致大鼠腦血管內(nèi)皮依賴性舒張功能下降，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活，ROS水平升高。因此，持久的氧化應激造成內(nèi)皮細胞的損傷可能是長期飲酒導致腦血管穩(wěn)態(tài)失衡的重要原因之一。
　　2.過量、持久的乙醇刺激可誘導血管內(nèi)皮細胞發(fā)生凋亡;而乙醛則可以通過誘導內(nèi)皮細胞產(chǎn)生大量的ROS，激活ERK快速誘導內(nèi)皮細胞發(fā)生自噬，參與細胞損傷過程。
　　3.過量乙