EDHF參與腦血管痙攣的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　內(nèi)皮源性的舒張因子主要包括：NO，PGI2以及EDHF，隨著血管管徑的變小，EDHF調(diào)節(jié)血管舒張的作用就愈發(fā)重要。EDHF調(diào)節(jié)血管的舒張作用依賴于正常的GJ通道功能，完成一個(gè)完整的EDHF反應(yīng)依賴于各細(xì)胞間正常的縫隙連接介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊（GJIC）功能，其中Cx40及其相關(guān)GJ通道對(duì)EDHF舒張血管的作用至關(guān)重要，沉默Cx40表達(dá)可使ACh激發(fā)的EDHF血管舒張作用減弱。前期研究表明：1、SAH后發(fā)生腦血管痙攣。2、S

2、AH后Cx43較正常腦血管明顯上升，Cx40上升不明顯。3、Cx43 siRNA腺病毒可下調(diào)Cx43的表達(dá)改善腦血管痙攣以及縫隙連接阻斷劑甘珀酸（CBX）同樣可以改善腦血管痙攣。我們推測(cè)，SAH后EDHF調(diào)節(jié)腦血管舒張功能障礙而發(fā)生腦血管痙攣原因是腦血管Cx發(fā)生重構(gòu)，Cx43與Cx40的比例失調(diào)，導(dǎo)致GJ通道功能改變，EDHF調(diào)節(jié)腦血管舒張的作用下降，隨后發(fā)生腦血管痙攣。為此，本實(shí)驗(yàn)旨在：1、比較正常大鼠和SAH大鼠的基底動(dòng)脈EDHF反

3、應(yīng)。2、利用Cx43 siRNA腺病毒下調(diào)Cx43的表達(dá)，CBX阻斷SAH模型中的異常GJ通道，檢測(cè)基底動(dòng)脈中EDHF反應(yīng)的變化，通過(guò)以上研究進(jìn)一步明確EDHF參與SAH后腦血管痙攣的機(jī)理，為改善SAH的臨床預(yù)后尋找新的有效方法。
　　方法：
　　1、SAH模型的建立及鑒定：正常SD大鼠腹腔麻醉，尾靜脈取血約0.3ml左右備用，顯微鏡下枕大池緩慢注射，24小時(shí)后進(jìn)行二次注血，從而完成二次注血的蛛網(wǎng)膜下腔出血模型的建立。模型鑒

4、定：取正常組，SAH3、7天大鼠基底動(dòng)脈行HE染色。
　　2、正常及SAH模型基底動(dòng)脈EDHF反應(yīng)以及Cx43的表達(dá)：1）取SD大鼠基底動(dòng)脈環(huán)游離后先用含前列環(huán)素抑制劑吲哚美辛（Indo）和一氧化氮合酶抑制劑N-硝基-L-硝基精氨酸（L-NAME）并通95％O2+5% CO2混合氣體充分飽和的PSS液預(yù)處理，再用60mmol/L KCl KPSS刺激預(yù)收縮，最后加入不同濃度ACh（10-9-10-5mol/L），使基底動(dòng)脈環(huán)產(chǎn)生E

5、DHF反應(yīng)，通過(guò)powerlab生理信息采集與處理系統(tǒng)記錄各濃度ACh的張力值并計(jì)算出舒張百分比。2）取正常及SAH模型組SD大鼠進(jìn)行體內(nèi)多聚甲醛固定，再分離出基底動(dòng)脈體外固定行石蠟包埋后，進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，觀察Cx43在基底動(dòng)脈環(huán)中的表達(dá)情況。
　　3、Cx43 siRNA腺病毒預(yù)處理SAH模型的EDHF反應(yīng)及Cx43表達(dá)：1）Cx43腺病毒沉默效率的檢測(cè)：Cx43 siRNA腺病毒、空病毒分別行枕大池注射，設(shè)立Cx43病毒處理

6、組、空病毒組，于0（正常）、3、7、14天處死SD大鼠，通過(guò)基底動(dòng)脈的Western blotting來(lái)檢測(cè)Cx43 siRNA腺病毒的沉默效率。2）造SAH模型前一周，枕大池注射Cx43 siRNA腺病毒、空病毒對(duì)SD大鼠進(jìn)行干預(yù)，預(yù)處理后再行SAH模型建立，最后檢測(cè)Cx43 siRNA腺病毒、空病毒預(yù)處理SAH模型的EDHF反應(yīng)以及免疫組化觀察Cx43 siRNA腺病毒預(yù)處理SAH模型的Cx43的表達(dá)。
　　4、甘珀酸預(yù)處理S

7、AH模型后EDHF反應(yīng)的變化：試驗(yàn)前取SAH模型組基底動(dòng)脈用甘珀酸預(yù)處理30min，預(yù)處理完成后再行EDHF反應(yīng)的測(cè)定。
　　結(jié)果：
　　1、SAH模型基底動(dòng)脈通過(guò)HE染色可見(jiàn)管腔變窄、內(nèi)皮層增厚、皺縮明顯，提示模型建立成功。
　　2、Western blotting的結(jié)果顯示：1）Cx43 siRNA腺病毒處理0（正常）、3、7、14天的Cx43蛋白表達(dá)情況為：0.796±0.02、0.604±0.03、0.369±

8、0.04、0.394±0.01。其中病毒處理后3天Cx43表達(dá)下調(diào)（P<0.05），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;病毒處理7、14天后Cx43顯著下降（P<0.01）。2）空病毒處理0、3、7、14天的Cx43表達(dá)情況為：0.68±0.04、0.67±0.01、0.69±0.03、0.70±0.02，處理3、7、14天后 Cx43表達(dá)無(wú)明顯差異性（P>0.05）。
　　3、Cx43免疫組化的結(jié)果示：SAH后Cx43的陽(yáng)性棕黃著色在內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌

9、細(xì)胞、外膜細(xì)胞均有不同程度上升；Cx43 siRNA腺病毒預(yù)處理SAH后，Cx43的陽(yáng)性棕黃著色在平滑肌細(xì)胞、外膜細(xì)胞有一定的下降。
　　4、游離血管環(huán)張力試驗(yàn)示：正常SD大鼠的基底動(dòng)脈環(huán)張力實(shí)驗(yàn)中ACh激發(fā)EDHF反應(yīng)引起的舒張反應(yīng)最大的舒張百分比為41.084±5.459%；SAH組3、7天的最大舒張百分比為7.096±5.573%、5.142±2.579%與正常組比有顯著的差異（P<0.05）；空病毒預(yù)處理 SAH3、7天組

10、最大舒張百分比為7.722±4.516%、8.714±2.641%與SAH模型組比差異不明顯（P>0.05）；Cx43 siRNA腺病毒預(yù)處理SAH3、7天組最大舒張百分比為51.268±14.072%、50.284±5.572%與SAH模型組比有顯著差異（P<0.05）；甘珀酸預(yù)處理SAH3、7天組最大舒張百分?jǐn)?shù)分別為41.924±6.246%、42.50±13.693%與SAH模型組比有顯著的差異（P<0.05）。
　　結(jié)論：

11、
　　1、SAH后腦血管痙攣的發(fā)生發(fā)展與EDHF舒張作用減弱有關(guān)。
　　2、SAH后EDHF舒張功能減弱與Cx43上升后Cx43與Cx40比例失調(diào)，GJ重構(gòu)，GJ通道功能障礙有關(guān)。
　　3、甘珀酸抑制SAH后異常重構(gòu)的GJ通道，EDHF舒張血管功能得到恢復(fù)，CVS得到緩解。
　　4、通過(guò)Cx43 siRNA腺病毒下調(diào)Cx43的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)SAH后GJ重構(gòu)，改善GJ通道功能，EDHF舒張血管功能得到恢復(fù)，CVS得到緩