microRNA10b在HGF誘導(dǎo)的MSCs定向遷移中的作用.pdf

1、間充質(zhì)干細(xì)胞(marrow mesenchymal stem cells，MSCs)是存在于骨髓、脂肪、肌肉等多種組織的成體干細(xì)胞，因其具有來源廣泛，易于體外擴(kuò)增，無免疫原性等優(yōu)點(diǎn)近年來被廣泛地應(yīng)用于治療心肌缺血，骨發(fā)育不全，骨折，腦損傷等一些疾病中。MSCs具有多向分化潛能，其不僅可以分化為中胚層來源細(xì)胞例如成骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞、軟骨細(xì)胞，而且還可以誘導(dǎo)分化成外胚層來源的神經(jīng)細(xì)胞，具有神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)，并且表達(dá)神經(jīng)元特異性的標(biāo)志。有研究表

2、明MSCs可以定向遷移到損傷組織、慢性炎癥部位及腫瘤部位，因此成為代替神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)治療惡性膠質(zhì)瘤等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的理想載體。MSCs在體內(nèi)定向遷移到受損組織的具體機(jī)制尚不明確，有研究發(fā)現(xiàn)MSCs因其表達(dá)特定類型的趨化因子受體，能夠應(yīng)答腫瘤區(qū)域所產(chǎn)生的特定趨化因子，從而引發(fā)MSCs定向遷移行為。MSCs表達(dá)HGF受體c-met，并且在體外HGF能明顯促進(jìn)MSCs的遷移。在惡性膠質(zhì)瘤分泌的很多細(xì)胞

3、因子中，NSCs對HGF的趨化性應(yīng)答最強(qiáng)。
　　 microRNA是一段由20-25nt組成的非編碼RNA，通過其5＇末端6-8個堿基的seed區(qū)域與多個mRNA的3＇UTR區(qū)不完全配對來影響mRNA的翻譯與穩(wěn)定性，在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后水平上起著重要的調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞決定與行為受到很多microRNA的調(diào)控，并且在不同類型細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)調(diào)控其遷移行為的microRNA分子。microRNA17/20, microRNA10b

4、, miRNA151, microRNA-146b和microRNA23同過靶向不同基因的mRNA影響腫瘤細(xì)胞遷移，microRNA9，microRNA124在神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)，影響神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育及遷移，microRNA145在維持胚胎干細(xì)胞自我更新與分化間的平衡及腫瘤細(xì)胞的侵襲中發(fā)揮重要作用。以上結(jié)果表明，這些與遷移相關(guān)的microRNA分子可能在HGF誘導(dǎo)的MSCs定向遷移過程中發(fā)揮重要作用。
　　 本研究首先利用MiniOp

5、ticon real-time PCR檢測經(jīng)5ng/mlHGF刺激30min，與未刺激組MSCs中九種與遷移相關(guān)microRNA的差異表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)經(jīng)因子刺激后MSCs中microRNA145，microRNA17-5p, microRNA-181，microRNA9的表達(dá)量顯著上調(diào)，而microRNA10b，microRNA124及microRNA146表達(dá)量顯著下調(diào)。因microRNA10b通過靶基因Tiam1和HoxD10分別影響

6、下游Rac1及RhoC的活性，與細(xì)胞遷移有密切的聯(lián)系。故本研究將microRNA10b作為研究對象，進(jìn)一步檢測分別改變micoRNA10b與下游分子Rac1的表達(dá)對HGF誘導(dǎo)的MSCs定向遷移的影響。
　　 為了研究改變microRNA10b表達(dá)對HGF誘導(dǎo)MSCs定向遷移的影響，我們使用Dunn chamber裝置和延時動態(tài)視頻(time-lapsevideo)跟蹤拍攝，分別檢測轉(zhuǎn)染microRNA10b表達(dá)載體及抑制子的MS

7、Cs在HGF刺激下的具體遷移指標(biāo)，包括細(xì)胞的遷移速率和遷移效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)高表達(dá)microRNA10b后，HGF誘導(dǎo)MSCs的定向遷移速率沒有明顯變化，遷移效率顯著下調(diào)；抑制microRNA10b后，HGF誘導(dǎo)MSCs的定向遷移速率和遷移效率均顯著上調(diào)。
　　 Rac1作為microRNA10b下游信號分子通過調(diào)節(jié)肌動蛋白骨架的重排、粘著斑的周轉(zhuǎn)及細(xì)胞片狀偽足的伸展調(diào)控細(xì)胞鋪展、細(xì)胞極性與細(xì)胞遷移。為了更好地研究Rac1對MSCs

8、定向遷移的影響，我們構(gòu)建了Rac1及其突變體Rac1Q61L、Rac1G12V、Rac1T17N腺病毒表達(dá)載體，并制備出病毒，檢測病毒滴度為107 pfu/ml后感染MSCs，經(jīng)篩選發(fā)現(xiàn)150MOI為最適MSCs的病毒感染復(fù)數(shù)。
　　 最后我們利用Dunn chamber裝置，檢測經(jīng)腺病毒Ad，Ad-Rac1，Ad-Rac1Q61L，Ad-Rac1G12V, Ad-Rac1T17N感染的MSCs趨向HGF的個體性遷移指標(biāo)，包括遷

9、移速率和遷移效率。發(fā)現(xiàn)高表達(dá)Rac1即感染Ad-Rac1Q61L的MSCs遷移速率顯著上升，遷移效率沒有明顯變化；高表達(dá)野生型Rac1即感染Ad-Rac1的MSCs遷移效率和遷移速率均無明顯變化；降低阻斷Rac1活性即感染Ad-Rac1T17N的MSCs遷移遷移效率和遷移速率均顯著降低。利用Boyden chamber檢測感染Rac1及突變體后MSCs的群體性遷移行為，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)活性Rac1與野生型Rac1能明顯促進(jìn)細(xì)胞群體性遷移，阻斷

10、Rac1活性則會明顯抑制MSCs群體性遷移。
　　 以上結(jié)果表明，改變microRNA10b及下游分子Rac1的表達(dá)均能影響HGF誘導(dǎo)的MSCs的定向遷移行為，下一步實(shí)驗將繼續(xù)研究利用實(shí)時定量PCR檢測出的其他具有顯著差異表達(dá)microRNA（如microRNA124，microRNA9等）的功能，以期找到多條microRNA通路間的聯(lián)系，為進(jìn)一步揭示調(diào)控MSCs定向遷移的分子機(jī)制及臨床應(yīng)用MSCs治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供理論依據(jù)。