TRPC1在fMLP誘導(dǎo)嗜中性粒細胞定向移動中作用的研究.pdf

1、研究背景：
　　 人嗜中性粒細胞在血液中占白細胞總數(shù)的60％-70％，是機體先天免疫應(yīng)答的重要組成部分，處于機體抵御外來微生物病原體，特別是化膿性細菌入侵的第一道防線。定向移動是真核細胞的基本生物生理學(xué)特征，包括極性化和趨化兩部分。細胞極性（cell polarity）對正常細胞尤其是人嗜中性粒細胞的遷移，細胞質(zhì)分裂以及細胞分化等生物學(xué)過程起到關(guān)鍵性的作用。目前所說的細胞極性是指細胞為了行使某些特殊的生理功能或產(chǎn)生定向的分化，位

2、于胞內(nèi)的信號分子產(chǎn)生不對稱分布致使細胞在形狀上產(chǎn)生不對稱性，具體表現(xiàn)為胞內(nèi)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等信號物質(zhì)不對稱分布，細胞骨架、胞內(nèi)其他物質(zhì)發(fā)生重構(gòu)。極性細胞外形特征是形成寬大的頭部即是偽足，狹窄的尾部稱為尾足。細胞趨化(Cellchemotaxis)是指細胞感受到內(nèi)外源趨化物質(zhì)，并且能順著趨化物質(zhì)濃度梯度到達趨化物質(zhì)所在的部位，從而發(fā)揮生物生理學(xué)作用。所以，定向移動是中性粒細胞基本的功能。
　　 中性粒細胞具有較強的定向遷移能力，一旦感

3、知趨化物質(zhì)的存在，細胞便能迅速形成以頭部寬大，尾部狹窄為特征的極性形態(tài)，到達趨化物質(zhì)存在的地方，發(fā)揮殺菌抗炎作用。盡管中性粒細胞生理功能如此重要，但中性粒細胞發(fā)揮定向遷移（趨化），殺菌抗炎作用的前提是依賴于極性的形成。定向遷移的基礎(chǔ)是細胞發(fā)生極性化，在極性化的基礎(chǔ)上進行趨化。但在中性粒細胞建立并維持極性形態(tài)的過程中，任何信號分子的調(diào)控失敗都會導(dǎo)致其生理功能異常。臨床上一些疾病如哮喘、敗血癥、缺血再灌注損傷、類風濕性關(guān)節(jié)炎、過敏反應(yīng)及一些

4、由于感染引起的器官衰竭反應(yīng)等都與中性粒細胞極性功能增強或減弱導(dǎo)致的定向移動異常密切相關(guān)。因此，研究調(diào)控中性粒細胞極性化和趨化性形成的分子機制，對防止和治療中性粒細胞功能異常導(dǎo)致的機體組織損傷具有重大的藥理和臨床意義。
　　 近年來，研究細胞胞內(nèi)游離鈣濃度（cytosolicfree Ca2+concentration，[Ca2+]i）和分布的變化參與中性粒細胞多種功能的調(diào)節(jié)，如極性化趨化等已成為熱點。已有文獻報道人中性粒細胞由于

5、缺乏電壓門控鈣通道(voltage-gated calciumchannels，VGCC)，細胞的外鈣內(nèi)流主要由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫清空引起質(zhì)膜上的鈣通道開放導(dǎo)致外鈣內(nèi)流，這就是所謂的鈣庫操縱鈣離子通道(store-operated Ca2+entry，SOCE)。目前除了STIM1和Oria1蛋白是組成SOCE的兩種必需蛋白分子，大部分學(xué)者認為SOCE另一個重要的候選分子是瞬時受體電位通道(transientreceptor potential

6、 channel，TRP)中C家族成員TRPC1（TRP-canonical1）分子。TRP被認為可能是鈣庫操縱性鈣通道的分子基礎(chǔ)，原因可能是它與胞內(nèi)鈣離子濃度變化密切相關(guān)而且可能被其激活，TRPC是TRP家族的主要成員之一，在哺乳動物體內(nèi)有非常廣泛的表達，TRPC包括7個亞型，TRPC1-7，各亞型的分布與功能有所差別。其中TRPC1分布很廣，在骨骼肌、腎臟、腦、皮膚、肺、前列腺、心臟、睪丸和卵巢里都有高水平表達。在哺乳動物中最早被發(fā)

7、現(xiàn)的TRP通道是TRPC1，其公認的作用是鈣依賴的分泌、收縮和參與受體介導(dǎo)。TRPC1通常和包括PLC和IP3受體等蛋白組成信號復(fù)合物參與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，這種復(fù)合物的功能通過在胞膜的特定脂質(zhì)環(huán)境上組裝得到實現(xiàn)。作為SOCE重要的候選分子，TRPC1蛋白是細胞膜上非選擇性鈣通道，目前對TRPC1在極性化以及趨化過程中的作用研究很少，尤其是從膜電流角度去分析TRPC1的作用就更少。因此，利用膜片鉗技術(shù)從電生理學(xué)的角度去研究TRPC1在中性粒細

8、胞極性化以及趨化過程中的作用，探討中性粒細胞極定向移動過程中TRPC1是否參與，在這個過程中起什么作用，如果TRPC1參與定向移動，那么如何調(diào)控細胞膜電流來達到定向移動的。目前對這方面的研究不多，本課題所開展的實驗就是為了回答這些問題，為研究中性粒細胞定向移動提供電生理學(xué)理論依據(jù)。
　　 目前已經(jīng)證實中性粒細胞能夠被大量的趨化物包括內(nèi)源的趨化物激活，如白細胞介素8(interleukin8，IL-8)、血小板激活因子(palle

9、t acticated factor, PAF)、補體成分C5a(complement component factor5a)和外源的趨化物質(zhì)激活，如甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine，fMLP)等。當中性粒細胞感知到趨化物fMLP，fMLP刺激細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫釋放鈣離子，細胞迅速朝趨化物濃度高的方向建立起一個頭寬尾窄的極性形態(tài)，細胞骨架結(jié)構(gòu)重構(gòu)，促進極性的形成。

10、細胞受到趨化物刺激形成極性，在這過程中細胞迅速啟動胞內(nèi)一系列復(fù)雜的極性信號機制，但是目前對這機制還不十分清楚，就極性過程中TRPC1如何調(diào)控極性細胞膜電流尚未見報道。本研究就是在外源趨化劑fMLP誘導(dǎo)人嗜中性粒細胞極性化的背景下去探討TRPC1是否參與定向移動，如何調(diào)控細胞膜電流，對極性化、趨化過程中膜電流的影響。
　　 目的：
　　 本實驗通過使用均一、低濃度的外源趨化劑fMLP作用于人嗜中性粒細胞，建立細胞極性模型。

11、應(yīng)用TRPC1蛋白抗體、阻斷劑(GsMTx-4)封閉和阻斷TRPC1蛋白通道，進而通過膜片鉗技術(shù)記錄中性粒細胞膜電容、各種處理因素TRPC1相關(guān)膜電流的變化，比較相應(yīng)的電流密度，以及通過Zigmond chamber觀察上述試劑對中性粒細胞極性趨化性的影響，利用Transwell小室觀察TRPC1抗體、阻斷劑(GsMTx-4)對嗜中性粒細胞遷移的影響，探討TRPC1是否參與中性粒細胞極性化、趨化過程以及TRPC1在其中起什么作用，對膜電

12、流有什么影響。
　　 方法：
　　 1.采用經(jīng)典的密度梯度離心法急性分離人嗜中性粒細胞，主要包括Dextran沉降，標準的梯度密度離心和低滲裂解殘存紅細胞三個步驟。首先使用葡聚糖T-500（Dextran-T500）沉降紅細胞，接著淋巴細胞分離液密度梯度離心，最后殘存紅細胞再裂解。獲得的中性粒細胞進行瑞氏-吉姆薩染色和臺盼藍染色，分析中性粒細胞的純度、活性。
　　 2.采用5步法拉制有芯微電極，并進行拋光處理，使

13、用膜片鉗相應(yīng)儀器檢測電極電阻。
　　 3.采用膜片鉗相關(guān)儀器進行中性粒細胞封接和破膜，記錄膜電容和各種處理因素后TRPC1相關(guān)電流的變化。
　　 4.在外源趨化劑fMLP存在的情況下，使用Zigmond chamber觀察細胞受到TRPC1抗體作用的形態(tài)學(xué)變化。
　　 5.通過Transwell小室實驗檢測中性粒細胞的定向遷移率的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.5步拉制并經(jīng)拋光處理的微電極電阻為5

14、-7MΩ。
　　 2.人嗜中性粒細胞膜電容(Cm)為14.58 pF。
　　 3.TRPC1抗體、GsMTx-4均能引起中性粒細胞膜電流的下降，與對照組或/和fMLP組比較，電流密度變化均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 4.TRPC1抗體能降低fMLP誘導(dǎo)的嗜中性粒細胞極性率。
　　 5.TRPC1抗體、GsMTx-4均能導(dǎo)致人嗜中性粒細胞趨化能力的降低。
　　 結(jié)論：
　　 1.T