TRPC1、3在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞CaR介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流及NO生成中的作用和機(jī)制.pdf

1、目的:1探討瞬時型感受器電位1、3(TRPC1、3)在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)鈣敏感受體(CaR)介導(dǎo)鈣離子(Ca2+)內(nèi)流和一氧化氮(NO)生成的作用和機(jī)制。
　　方法:(1)胰蛋白酶消化原代培養(yǎng)HUVEC,倒置顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及免疫細(xì)胞化學(xué)法測Ⅷ因子對其進(jìn)行抗原鑒定。(2)用鈣池操縱的鈣離子通道(SOC)阻滯劑和/或受體操縱鈣離子通道(ROC)阻滯劑分別和/或聯(lián)合孵育細(xì)胞,采用Westernblotting技檢

2、測TRPC1和TRPC3蛋白的表達(dá)。(3)免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測TRPC1、TRPC3蛋白表達(dá)及定位。(4)利用轉(zhuǎn)染技術(shù)將構(gòu)建的TRPC1RNA、TRPC3RNA干擾質(zhì)粒(TRPC1shRNA、TRPC3shRNA)轉(zhuǎn)染入HUVEC中,實(shí)時定量RT-PCR和Westernblotting檢測TRPC1shRNA、TRPC3shRNA轉(zhuǎn)染后的抑制效率。(5)取2~5代細(xì)胞隨機(jī)分組:實(shí)驗組(即精胺+Ca2++shTRPC1組和精胺+Ca2++

3、shTRPC3-004組),其余兩組分別為對照組(Control組,即精胺+Ca2+組),空質(zhì)粒組(Vehicle組,即精胺+Ca2++Vehicle組),分別將上述4組細(xì)胞與CaR激動劑(SOC和ROC均激活)、ROC模擬劑TPA及CaR負(fù)性變構(gòu)調(diào)節(jié)劑Calhex231(激活ROC、阻斷SOC)、PKC抑制劑Ro31-8220和經(jīng)典型PKCs和PKCμ抑制劑Go6976(阻斷ROC、激活SOC)孵育,各組用熒光探針DAF-FM、Fur

4、a-2/AM負(fù)載方法同步測定NO生成和[Ca2+]i的變化。(6)實(shí)驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,組間比較用單因素方差分析,均數(shù)間的比較采用t檢驗或卡方檢驗。所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行分析,以p<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:(1)細(xì)胞形態(tài)學(xué)與免疫細(xì)胞化學(xué)法測Ⅷ證實(shí)原代培養(yǎng)的細(xì)胞為HUVEC。(2)HUVEC經(jīng)SOC阻滯劑和/或ROC阻滯劑分別和/或聯(lián)合處理后,TRPC1和TRPC3蛋白的表達(dá)檢測結(jié)果顯示:

5、各加藥組與Control組(精胺+Ca2+組)相比,均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。(3)免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測顯示:TRPC1和TRPC3蛋白表達(dá)于胞漿,兩者共定位于胞漿。(4)Westernngblotting檢測結(jié)果顯示:與Control組相比,shTRPC1和shTRPC3-004干擾后,TRPC1和TRPC3蛋白的表達(dá)均降低(抑制率分別為83.4％和71.8%)(p<0.05),實(shí)時定量PCR檢測結(jié)果顯示:與Control組相比

6、,shTRPC1和shTRPC3-004干擾后,TRPC1和TRPC3mRNA的表達(dá)均降低(抑制率分別為39.0%和74.0%)(p<0.05)。(5)[Ca2+]i△ratio值和NO凈熒光強(qiáng)度值的測定結(jié)果如下:與精胺+Ca2+組的[Ca2+]i(△ratio=7.54±0.18)、NO凈熒光強(qiáng)度值(846.39±68.13)相比,精胺+Ca2++ShTRPC1組(△ratio=5.73±0.15)、(137.82±14.22)均明顯

7、降低(p<0.05);而精胺+Ca2++Vehicle組(△ratio=7.66±0.13)、(724.96±20.72);精胺+Ca2++ShTRPC3-004組(△ratio=7.37±0.12)、(794.685±20.60)沒有顯著差異(p>0.05)。與Calhex231+TPA+精胺+Ca2+組的[Ca2+]i(△ratio=4.64±0.07)、NO凈熒光強(qiáng)度值(176.20±14.13)相比,Calhex231+TPA+

8、精胺+Ca2++ShTRPC1組(△ratio=2.67±0.07)、(58.65±5.05)均明顯降低(p<0.05);而Calhex231+TPA+精胺+Ca2++Vehicle組(△ratio=4.43±0.14)、(175.31±16.89);Calhex231+TPA+精胺+Ca2++ShTRPC3-004組(△ratio=4.51±0.12)、(150.71±6.08)沒有顯著差異(p>0.05)。與與Ro31-8220+精

9、胺+Ca2+組的[Ca2+]i(△ratio=6.03±0.05)、NO凈熒光強(qiáng)度值(214.96±7.83)相比,Ro31-8220+精胺+Ca2++ShTRPC1組(△ratio=3.41±0.09)、(57.97±7.14)均明顯降低(p<0.05);而Ro31-8220+精胺+Ca2++Vehicle組(△ratio=5.90±0.03)、(207.34±10.2);Ro31-8220+精胺+Ca2++ShTRPC3-004組(

10、△ratio=5.90±0.07)、(192.52±19.21)沒有顯著差異(p>0.05)。與Go6976+精胺+Ca2+組)的[Ca2+]i(△ratio=5.98±0.02)、NO凈熒光強(qiáng)度值(199.16±6.93)相比,Go6976+精胺+Ca2++ShTRPC1組(△ratio=4.22±0.11)、(57.44±6.65)均明顯降低(p<0.05);Go6976+精胺+Ca2++Vehicle組(△ratio=6.03±0