MicroRNA-10a-5p在大鼠心衰發(fā)展中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　探討microRNA-10a-5p在大鼠心梗后心衰發(fā)生發(fā)展過程中的變化及其作用機(jī)制，并明確其在大鼠心肌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮的作用。
　　方法：
　　對(duì)健康SD大鼠行冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎（LAD）術(shù)建立心梗后心衰模型。通過監(jiān)測大鼠體重并用超聲心動(dòng)圖測量并計(jì)算大鼠左室短軸縮短率和左室射血分?jǐn)?shù)等指標(biāo)確定心衰模型的建立成功。培養(yǎng)出生1-3天的SD乳鼠心室肌細(xì)胞，苯腎上腺素（PE）誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大建立心肌細(xì)胞肥大模型，通過

2、觀察細(xì)胞表面積，測量心肌肥大標(biāo)志性基因表達(dá)變化等指標(biāo)確定肥大模型的成功建立。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人工合成的大鼠miRNA-10a-5p模擬物或抑制劑，使心肌細(xì)胞過表達(dá)miR-10a-5p或抑制其miR-10a的表達(dá)。
　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測miR-10a-5p的表達(dá)量及ANP，BNP等心衰標(biāo)志分子的mRNA水平表達(dá)量。Western Blot方法檢測心衰相關(guān)蛋白，凋亡相關(guān)蛋白及靶蛋白的表達(dá)量。生物信息學(xué)預(yù)測miR-10

3、a-5p的候選靶基因，采用雙熒光報(bào)告基因檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶的表達(dá)量，反映miRNA在離體體系中能否調(diào)控此基因表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　一、miR-10a-5p的表達(dá)量在心衰模型中升高
　　采用LAD成功建立大鼠心衰模型，心衰組（Mol）大鼠相比于假手術(shù)組(Sham)大鼠，體重下降，活動(dòng)減少，精神狀態(tài)差，毛發(fā)無光澤。結(jié)扎后，LVFS降低了近50%（P<0.01），LVEF降低了約35%（P<0.01）。相比于Sham組，

4、Mol-I組(Mol組心肌梗死區(qū))的ANP表達(dá)量增高約75倍（P<0.01），而BNP含量增高約17倍（P<0.01）。相比于Sham組，Mol-R（Mol組心肌非梗死區(qū)）組的ANP表達(dá)了增高約20倍（P<0.01），而BNP含量增高約15倍（P<0.05）。結(jié)扎組大鼠心臟梗死區(qū)（Mol-I）ANP mRNA水平表達(dá)量比Sham組增高了約75倍（P<0.01），結(jié)扎組大鼠非梗死區(qū)（Mol-R）ANP mRNA水平表達(dá)量比Sham組增高約

5、20倍（P<0.01）；如圖1-3所示，Mol-I組BNP的mRNA水平表達(dá)量比Sham組增高約17倍（P<0.01），Mol-R組BNP mRNA水平表達(dá)量比Sham組增高約15倍（P<0.05）。Mol組miR-10a-5p表達(dá)量比于Sham組增高了1.8倍（P<0.05）。
　　二、明確GATA6是miR-10a-5p的靶基因
　　生物信息學(xué)方法篩選出GATA6是miR-10a-5p的候選靶基因，雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果

6、顯示，miR-10a-5p能直接抑制GATA6的表達(dá)。Western Blot結(jié)果顯示，無論在心衰大鼠模型中還是在心肌肥大細(xì)胞中，miR-10a-5p和GATA6蛋白水平的變化都是相反的。過表達(dá)miR-10a-5p后，GATA6蛋白顯著降低。
　　三、miR-10a-5p的表達(dá)量在心肌細(xì)胞肥大模型中降低
　　PE誘導(dǎo)心肌細(xì)胞成功的建立了心肌細(xì)胞肥大模型。相比于CON組，PE50組ANP，BNP的表達(dá)量均增高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

7、相對(duì)于CON組，PE100組的ANP表達(dá)量增加了約18倍（P<0.01），BNP的表達(dá)量增加了約88倍（P<0.05）；相對(duì)于CON組，PE200組的ANP表達(dá)量增加了約37.5倍（P<0.01），而BNP增加了160多倍（P<0.01）。PE組較CON組細(xì)胞表面積顯著增加。PE組較CON組，miR-10a-5p表達(dá)量降低（P<0.01）。
　　四、miR-10a-5p促進(jìn)大鼠心肌細(xì)胞凋亡
　　PI單染后，熒光顯微鏡觀察結(jié)果

8、顯示，過表達(dá)miR-10a-5p后，凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)顯著增加；抑制miR-10a-5p的表達(dá)，凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)降低。Western Blot結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-10a-5p能增加cleaved-caspase3的蛋白表達(dá)量，抑制Bcl-2的蛋白表達(dá)量。
　　結(jié)論：
　　本研究通過大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎所建立的大鼠心梗后心衰模型和苯腎上腺素刺激所建立的體外培養(yǎng)的大鼠乳鼠心肌細(xì)胞肥大模型，利用分子生物學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)和生物信息學(xué)的方