TGEV S蛋白D位點和胞壁酰二肽及促吞噬素在干酪乳桿菌中的表達和免疫效果評價.pdf

1、豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV)能夠引起不同年齡和品種的豬發(fā)生以嘔吐、嚴重腹瀉和脫水為特征的胃腸炎，該病是一種高度傳染性病毒性腸道疾病，兩周齡以內(nèi)的仔豬致死率可達100％。黏膜免疫是對本病免疫保護的最佳途徑。本研究選用TGEVS蛋白中能夠誘導機體產(chǎn)生中和抗體的非糖基化的線性表位D抗原位點作為靶基因片段，通過乳酸菌系統(tǒng)對其進行表達，同時選擇胞壁酰二肽和

2、促吞噬素與D位點共表達，分析評價其對特異性免疫應答的影響。
　　 本實驗首先對胞壁酰二肽（Muramyl dipeptide，MDP）和促吞噬素(Tuftsin)二十聚體(20MT)進行密碼子優(yōu)化后，串聯(lián)形成四十聚體(40MT)。分別將20MT和40MT與6D相連，然后將6D、20MT-6D和40MT-6D分別克隆到pPG612載體中，電轉(zhuǎn)化干酪乳桿菌感受態(tài)細胞中，獲得陽性重組菌，分別命名為rLc∶pPG612-6Ds、rLc∶

3、pPG612-20MT-6Ds、rLc∶pPG612-40MT-6Ds。
　　 將重組菌rLc∶pPG612-6Ds、rLc∶pPG612-20MT-6Ds和rLc∶pPG612-40MT-6Ds在2％ D-木糖MRS培養(yǎng)基中誘導后，進行Western-blot檢測，結果表明:目的蛋白獲得表達，蛋白大小分別為27kDa、43kDa、59kDa，符合預期大小;取誘導后的培養(yǎng)上清，進行ELISA檢測，結果表明，三組重組菌經(jīng)誘導后，目

4、的蛋白均獲得了分泌表達。將6-8周齡BALB/c小鼠隨機分成5組，每組12只，口服免疫，分別為鮮奶對照組、rLc∶pPG612組、rLc∶pPG612-6Ds、rLc∶pPG612-20MT-6Ds和rLc∶pPG612-40MT-6Ds組?？诜庖呋罹繛?09個/只，連續(xù)三天灌服，每隔1周加強免疫一次，共免疫三次。分別于免疫前和免疫后定期采集各組血清、糞便、淚液、鼻黏液、外生殖道黏液。通過間接ELISA檢測，進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，結果表

5、明，rLc∶pPG612-20MT-6Ds和rLc∶pPG612-40MT-6Ds免疫組特異性IgA和IgG抗體水平均明顯高于rLc∶pPG612-6Ds，且rLc∶pPG612-20MT-6Ds免疫組抗體水平要高于rLc∶pPG612-40MT-6Ds免疫組。細胞中和試驗結果表明，rLc∶pPG612-6Ds，rLc∶pPG612-20MT-6Ds和rLc∶pPG612-40MT-6Ds組免疫小鼠所得血清的中和效價分別為1∶15、1∶

6、32和1∶60，腸黏膜抗體IgA中和效價分別為1∶32、1∶51和1∶64。研究結果表明，口服免疫表達6Ds、20MT-6D和40MT-6Ds蛋白的重組乳酸菌均能誘導產(chǎn)生系統(tǒng)免疫和黏膜免疫，經(jīng)口服免疫后，誘導產(chǎn)生的黏膜免疫反應不僅局限于胃腸道，還可以誘導其他黏膜部位產(chǎn)生特異性免疫反應。
　　 將新分離的免疫鼠脾細胞稀釋成5×106個/mL,經(jīng)流式細胞術檢測Th細胞亞類Th1、Th2、Th17和Treg，分析MT在Th細胞水平上對

7、免疫調(diào)節(jié)的作用途徑。實驗結果表明，rLc∶pPG612-20MT-6Ds和rLc∶pPG612-40MT-6D組的Th1、Th2和Th17相對于rLc∶pPG612-6D組和rLc∶pPG612組有明顯的增高，且差異極顯著。rLc∶pPG612-20MT-6Ds組的Th亞類細胞都明顯高于rLc∶pPG612-40MT-6D組，且差異極顯著。rLc∶pPG612-20MT-6Ds和rLc∶pPG612-40MT-6D組Th1/Th2細胞均

8、發(fā)生明顯平衡漂移，分析確定MT為Th1類型佐劑。同時，檢測Th17和Treg細胞水平，結果表明:rLc∶pPG612-6Ds、rLc∶pPG612-20MT-6Ds和rLc∶pPG612-40MT-6Ds三組的Th17細胞水平相對于rLc∶pPG612明顯上調(diào)，且差異極顯著，rLc∶pPG612-40MT-6Ds組顯著高于rLc∶pPG612-20MT-6Ds組。rLc∶pPG612-20MT-6Ds組和rLc∶pPG612-40MT-

9、6Ds組的Treg細胞水平相對于對照組rLc∶pPG612和rLc∶pPG612-6Ds組明顯降低，且差異極顯著。rLc∶pPG612-40MT-6Ds組的Treg細胞水平與rLc∶pPG612-20MT-6Ds組相比，下降更明顯，且差異極顯著。以上結果表明:MT為Th1型免疫增強劑，不僅可以增強特異性免疫應答水平，同時也具有調(diào)節(jié)免疫機制和抗免疫抑制的作用。
　　 綜上所述，本研究重組的干酪乳桿菌不僅誘導產(chǎn)生了體液免疫和黏膜免疫