定點(diǎn)改造的豬源胰高血糖素樣肽-2在植物乳桿菌中的表達(dá)及生物活性研究.pdf

1、在養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中，仔豬在斷奶期由于各種因素應(yīng)激，導(dǎo)致仔豬腸道形態(tài)和結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不同程度的破壞，導(dǎo)致食欲不振、腹瀉、生長停滯等所謂的“斷奶仔豬應(yīng)激綜合征”，嚴(yán)重影響仔豬的健康和養(yǎng)殖效益。GLP-2是一種特異性腸道營養(yǎng)因子，在特異性地促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的增殖、減輕腸細(xì)胞的凋亡和損傷、維持腸道黏膜的完整性方面發(fā)揮著重要的作用。但腸道內(nèi)的二酰肽酶 IV(Ddipeptidyl peptidase-IV，DPP-IV)對完整的GLP-2第二位的丙氨酸的酶

2、切，致使GLP-2的半衰期很短。因此，本研究對豬源胰高血糖素樣肽2（pGLP-2）基因進(jìn)行氨基酸定點(diǎn)改造，將 GLP-2的第二位的丙氨酸替換成甘氨酸，形成不被 DPP-IV酶切的p(Gly2)-GLP-2，并進(jìn)行植物乳桿菌(Lp1)的密碼子偏嗜性修飾，克隆至由超強(qiáng)啟動(dòng)子SCP驅(qū)動(dòng)外源基因表達(dá)的植物乳桿菌表達(dá)載體pSCPSP，成功構(gòu)建了表達(dá)載體 pSCPSP-p(Gly2)-GLP-2，將質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入植物乳桿菌 LP1。通過基因組 PCR

3、方法鑒定后獲得陽性重組轉(zhuǎn)化子pSCPSP-p(Gly2)-GLP-2-LP1，將24 h培養(yǎng)上清進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE檢測目的條帶，可觀察到4 KD左右目的條帶。并用pGLP-2 ELISA特異性檢測試劑盒檢測24 h、36 h、48 h時(shí)間培養(yǎng)上清中目的蛋白的含量，結(jié)果顯示隨著時(shí)間增加，表達(dá)量呈下降趨勢，最后確定最佳表達(dá)時(shí)間為24 h。為驗(yàn)證本試驗(yàn)表達(dá)的p(Gly2)-GLP-2的體內(nèi)生物活性，建立由DSS誘導(dǎo)的小鼠慢性