胰高血糖素樣肽-1對(duì)高糖所致乳鼠心室肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響及機(jī)制探討.pdf

1、目的：觀察胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)對(duì)高糖所致乳鼠心室肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響及探討PI3K-Akt通路在其中所起的作用。
　　 方法：將酶消化法經(jīng)α-肌動(dòng)蛋白免疫熒光法鑒定的原代培養(yǎng)72～96h的心室肌細(xì)胞分為5組：1)正常組(N組)：葡萄糖濃度為5.5mmol/L的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)72h；2)高糖組(H組)：葡萄糖濃度為25mmol/L的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)72h；3)高糖+GLP-1組(HG組)：葡萄糖濃度為25mmol

2、/L的DMEM中加入終濃度10nmol/L的GLP-1培養(yǎng)72h；4)高糖+GLP-1+LY294002組(HGL組)：葡萄糖濃度為25mmol/L的DMEM中加入終濃度為10nmol/L的GLP-1及終濃度為20μmol/LLY294002培養(yǎng)72h；5)高滲對(duì)照組(S組)：葡萄糖濃度為5.5mmol/L的DMEM中加入濃度為19.5mmol/L的甘露醇培養(yǎng)72h。采用硫代巴比妥酸顯色法測(cè)定細(xì)胞上清液中丙二醛(MDA)含量，用黃嘌呤氧

3、化酶法測(cè)定細(xì)胞上清液中超氧化物歧化酶(SOD)的活性，運(yùn)用PCR凝膠電泳檢測(cè)NADPH P47phox亞基mRNA的變化，運(yùn)用熒光顯微鏡及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心室肌細(xì)胞內(nèi)的ROS含量，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心室肌細(xì)胞的凋亡率。
　　 結(jié)果：⑴乳鼠心室肌細(xì)胞鑒定：熒光顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞胞漿內(nèi)均呈紅色熒光，即細(xì)胞內(nèi)表達(dá)α-肌動(dòng)蛋白，符合心室肌細(xì)胞的特征；⑵各組細(xì)胞上清液中MDA的含量變化：H組細(xì)胞上清液MDA的含量較N組有所增加(31.28±4

4、.60 vs3.80±1.62)；HG組MDA的含量較H組下降(10.41±2.72 vs31.28±4.60)；而HGL組與HG組相比MDA的含量有所增加(41.84±7.23 vs10.41±2.72)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05；S組MDA含量與N組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(4.31±2.36 vs3.80±1.62)，P＞0.05；⑶各組細(xì)胞上清液中SOD的含量變化：H組細(xì)胞上清液SOD的活性較N組有所下降(30.40±2.62

5、 vs58.51±6.58)；HG組SOD的活性較H組升高(46.36±2.85 vs30.40±2.62)：而HGL組與HG組相比SOD的活性下降(32.12±3.19 vs46.36±2.85)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05；S組SOD活性與N組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(57.82±3.97 vs58.51±6.58)，P＞0.05。⑷NAPDH P47phox亞基mRNA PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析：各組內(nèi)參基因條帶的亮度基

6、本一致；NADPHP47phox亞基：H組條帶亮于N組，HG組條帶較H組暗，HGL組條帶較HG組亮度有所增加，S組條帶亮度與N組相比無(wú)明顯差異。⑸各組細(xì)胞內(nèi)ROS的含量變化，熒光顯微鏡下所見(jiàn)結(jié)果分析：熒光顯微鏡下見(jiàn)ROS陽(yáng)性細(xì)胞內(nèi)呈綠色熒光；N組與S組細(xì)胞幾乎無(wú)表現(xiàn)綠色熒光的細(xì)胞；H組可見(jiàn)明顯的表現(xiàn)綠色熒光的細(xì)胞：HG組可見(jiàn)表現(xiàn)綠色熒光的細(xì)胞，但細(xì)胞數(shù)較H組減少，且熒光的強(qiáng)度較H組下降；HGL組可見(jiàn)表現(xiàn)綠色熒光的細(xì)胞，熒光強(qiáng)度較HG組增

7、強(qiáng)。⑹流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)ROS陽(yáng)性細(xì)胞率結(jié)果分析：與熒光顯微鏡下所見(jiàn)趨勢(shì)相同；H組與N組(36.97±2.87 vs1.83±1.2)，HG組與H組(19.04±3.79 vs36.97±2.87)，HGL組與HG組(58.65±8.19 vs19.04±3.79)，相比陽(yáng)性細(xì)胞率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，(P＜0.05)，；H組與S組(1.83±1.2 vs1.13±0.21)相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑺流式細(xì)胞術(shù)所測(cè)各組心肌細(xì)胞凋亡率結(jié)果

8、分析：H組與S組細(xì)胞幾乎無(wú)凋亡細(xì)胞，大部分細(xì)胞位于B3區(qū)；H組細(xì)胞凋亡率為(11.2±1.68)，與N組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；HG組細(xì)胞凋亡率為(6.27±1.00)，與H組相比，凋亡細(xì)胞所占比率下降；HGL組細(xì)胞凋亡率與HG組相比，凋亡率有所升高，P＜0.05。
　　 結(jié)論：①高糖可以誘導(dǎo)心室肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷并誘導(dǎo)心室肌細(xì)胞凋亡；②胰高血糖素樣肽-1可以逆轉(zhuǎn)高糖所致的心室肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷及凋亡，對(duì)心室肌細(xì)胞起保護(hù)作用；③P