胰高血糖素樣肽-1對糖尿病大鼠心臟自噬調(diào)節(jié)機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　比較胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）受體激動劑利拉魯肽（Liraglutide）干預(yù)前后糖尿病大鼠心肌自噬標(biāo)記分子LC3BmRNA表達(dá)及其蛋白含量，光鏡下觀察心肌脂肪沉積及纖維結(jié)構(gòu)的改變，探討 GLP-1對糖尿病大鼠心肌自噬調(diào)節(jié)的機(jī)制。
　　阻斷自噬通路后，繼續(xù)觀察利拉魯肽對糖尿病大鼠心肌脂質(zhì)沉積及纖維結(jié)構(gòu)的影響，進(jìn)一步驗證 GLP-1是通過調(diào)節(jié)自噬而發(fā)揮對糖尿病心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　方法：
　　

2、1、研究設(shè)計：
　　應(yīng)用高糖高脂飲食聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素建立糖尿病大鼠模型，成模后予以利拉魯肽干預(yù)4周，觀察大鼠一般特征，檢測內(nèi)臟脂肪相對含量、血糖、血脂，測定自噬標(biāo)志物L(fēng)C3BmRNA表達(dá)及其蛋白含量，光鏡下觀察大鼠心肌脂肪沉積及纖維結(jié)構(gòu)的改變，對自噬水平與脂質(zhì)沉積程度進(jìn)行相關(guān)性分析，并與未干預(yù)組相比較。
　　應(yīng)用氯喹抑制自噬體與溶酶體結(jié)合阻斷自噬通路后，再比較各組大鼠一般特征、內(nèi)臟脂肪含量、血糖、血脂、LC3BmRNA表

3、達(dá)及其蛋白含量、心肌脂質(zhì)沉積和纖維結(jié)構(gòu)，并與對照組和未阻斷組相比較。
　　2、實驗方法
　　（1）糖尿病大鼠模型制備：36只4~5周齡的健康雄性Wistar大鼠，體重180~200g購于北京動物飼養(yǎng)中心，每籠6只，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，采用簡單隨機(jī)抽樣法分為非造模組（10只）和造模組（26只）。對照組以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，每克飼料提供熱量13.4kJ，其中脂肪占10.2％，蛋白質(zhì)23.3%，碳水化合物66.5%；造模組以高糖高脂飼料喂

4、養(yǎng)，每克飼料提供熱量21.8kJ，脂肪占56.0%，蛋白質(zhì)7%，碳水化合物37.0%。早晚各喂養(yǎng)1次，自由飲水。飼養(yǎng)環(huán)境：光照12小時，室溫18~22℃，相對濕度30%～70%。每2周測大鼠體重、空腹血糖（FBG）。12周時，非造模組大鼠FBG為4.4~4.9 mmol/L，造模組大鼠FBG為5.3~5.9mmol/L，隔夜禁食12h后，造模組大鼠按25mg/Kg腹腔注射鏈脲佐菌素溶液，非造模組大鼠腹腔注射等體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。

5、72h后鼠尾采血測定兩組大鼠FBG，以FBG≥7.8mmol/L并持續(xù)一周以上為糖尿病造模成功，其中造模組成模25只，死亡1只。非造模組大鼠FBG均在正常范圍內(nèi)。
　?。?）大鼠分組及檢測指標(biāo)：非造模組大鼠設(shè)為正常對照組（NC組 n=10），繼續(xù)予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)。成模的25只糖尿病大鼠采用簡單隨機(jī)抽樣法分為：糖尿病對照組（DMNS組，n=9）、利拉魯肽干預(yù)組（LIR組，n=8）及利拉魯肽+自噬抑制劑氯喹組（LIR+CQ組，n=8），

6、三組繼續(xù)予高糖高脂飼料喂養(yǎng)。LIR組以100ug/Kg每天兩次腹部皮下注射利拉魯肽溶液，LIR+CQ組以100ug/Kg每天兩次腹部皮下注射利拉魯肽溶液的同時以50mg/Kg每兩天一次腹腔注射氯喹， DMNS組、NC組腹部注射等體積生理鹽水。每周六測定各組大鼠體重及FBG。上述藥物干預(yù)大鼠4周后，隔夜禁食12h，測定體重，鼠尾采血測定FBG、50%葡萄糖注射液灌胃（4ml/kg）測定餐后2小時血糖（2hBG）。次日空腹腹腔注射20%烏拉

7、坦溶液（4ml/kg）麻醉大鼠，開腹后經(jīng)腹主動脈取血，迅速離心后測定甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL-C）。采血后迅速分離心臟，PBS液沖洗后，切取三塊約100mg的心臟組織，錫箔紙包裹放于凍存管，迅速投入液氮罐中保存，待行實時熒光定量PCR測定LC3BmRNA水平；取左心室部分組織浸泡于10%甲醛液，固定48h后石蠟包埋，備做病理切片，用于免疫組化測定LC3B蛋白的表達(dá)及光學(xué)顯微鏡下觀察

8、心臟脂肪沉積及心肌纖維情況。分離內(nèi)臟脂肪（睪丸脂肪墊、雙側(cè)腎周脂肪、腹膜處及腸管間脂肪），稱重，并計算內(nèi)臟脂肪與體重的比值即內(nèi)臟脂肪相對含量（VF/W）。
　　（3）統(tǒng)計學(xué)方法：所有計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，運(yùn)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析，組間比較采用單因素方差分析（oneway-ANOVA）、LSD-t檢驗，兩變量相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.各組大鼠一

9、般特征比較：適應(yīng)性喂養(yǎng)期間，大鼠飲食量、體重?zé)o明顯差異，精神狀態(tài)良好，毛色光澤。造模期間，造模組大鼠較非造模組大鼠飲食量、體重均增加。造模成功后，藥物干預(yù)期間，NC組大鼠飲食量較之前無變化，體重呈穩(wěn)定增長，精神狀態(tài)良好，毛色光澤；DMNS組大鼠較同期NC組大鼠體重增加，少動；LIR組大鼠較同期NC組大鼠飲食量及體重?zé)o差異，較同期DMNS組大鼠飲食量、體重均下降，精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)；LIR+CQ組大鼠精神萎靡，體毛蓬松失去光澤，有脫毛現(xiàn)象，較同

10、期NC組大鼠飲食量、體重增加，與同期DMNS組大鼠比較，飲食量、體重?zé)o差別。
　　與NC組比較，DMNS組、LIR+CQ組大鼠內(nèi)臟脂肪相對含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），LIR組內(nèi)臟脂肪相對含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與DMNS組比較，LIR+CQ組大鼠內(nèi)臟脂肪相對含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞
　　0.05），LIR組內(nèi)臟脂肪相對含量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　2.各組大鼠生化指標(biāo)

11、比較：與NC組比較，DMNS組、LIR+CQ組大鼠FBG、2hBG、TG、TC、LDL-C升高，HDL降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；LIR組上述指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與DMNS組比較，LIR組大鼠FBG、2hBG、TG、TC、LDL-C降低，HDL升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.05）；LIR+CQ組上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與LIR組比較，LIR+CQ組FBG、2hBG、TG、TC、LD

12、L-C升高，HDL降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.05）
　　3.各組大鼠心肌自噬水平及脂肪沉積比較：與NC組比較，DMNS組、LIR+CQ組大鼠LC3B蛋白及mRNA表達(dá)降低，泡沫細(xì)胞/總心肌細(xì)胞數(shù)比值升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.05），LIR組大鼠LC3B蛋白及mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），泡沫細(xì)胞/總心肌細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與DMNS組比較， LIR組大鼠LC3B蛋白及mRNA表達(dá)升高

13、、泡沫細(xì)胞/總心肌細(xì)胞數(shù)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.05），LIR+CQ組大鼠LC3B蛋白及mRNA表達(dá)、泡沫細(xì)胞/總心肌細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　4.心肌自噬水平與脂質(zhì)沉積相關(guān)性分析：對泡沫細(xì)胞/總心肌細(xì)胞數(shù)比值與LC3BmRNA及其蛋白含量作Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果提示心肌LC3BmRNA表達(dá)、LC3B蛋白含量與泡沫細(xì)胞/總心肌細(xì)胞數(shù)比值呈顯著負(fù)相關(guān)（P﹤0.05）。
　　5.各組大鼠心肌病

14、理學(xué)比較： NC組大鼠心肌纖維排列整齊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，染色均勻，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形居中，未見泡沫細(xì)胞。DMNS組大鼠心肌滿布泡沫細(xì)胞，細(xì)胞核被擠向細(xì)胞一側(cè)，心肌纖維排列紊亂、斷裂。LIR組大鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)恢復(fù)，細(xì)胞內(nèi)未見明顯核固縮、核溶解。LIR組與DMNS組比較，心肌泡沫細(xì)胞數(shù)量減少，心肌纖維排列較整齊；與NC組比較，心肌泡沫細(xì)胞數(shù)量增多，心肌纖維排列無明顯變化。LIR+CQ組與NC組比較，心肌泡沫細(xì)胞數(shù)量增多，肌纖維斷裂、排列紊亂