胰高血糖素樣肽-1對大鼠骨骼肌細(xì)胞作用機(jī)制的研究-PI3K通路.pdf

1、目的： 1．體外培養(yǎng)大鼠骨骼肌細(xì)胞。 2．研究胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）對大鼠骨骼肌細(xì)胞的作用機(jī)制-PI3K通路。 3．為GLP-1相關(guān)藥物的臨床應(yīng)用的安全性和有效性提供理論依據(jù)。 方法： 1．體外培養(yǎng)大鼠骨骼肌細(xì)胞，通過倒置顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察。 2．實(shí)驗(yàn)分三步： 第一步：MTT方法檢查GLP-1、INS對骨骼肌細(xì)胞存活數(shù)量的影響

2、，是否有疊加作用。 第二步：免疫細(xì)胞化學(xué)法來初步驗(yàn)證GLP-1對大鼠骨骼肌細(xì)胞糖原合成作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路-PI3K通路。分組為：Ctrl組，GLP-1（1nmol/1）組，GLP-1（1nmol/l）+LY294002（15μmol/l）組，INS（1nmol/l）組，GLP-1（1nmol/l）+INS（1nmol/l）組。 第三步：蛋白質(zhì)印跡（western blot）來驗(yàn)證GLP-1對大鼠骨骼肌細(xì)胞糖原合成作用的信

3、號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路-PI3K通路。主要分組方法為：Ctrl組，GLP-1（1nmol/l）組，GLP-1（1nmol/l）+LY294002（15μmol/l）組，LY294002（15μmol/l）組。 3．免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測糖原合成酶（GS）和磷酸化的糖原合成酶激酶-3α/β（pGSK-3α/β）在骨骼肌細(xì)胞的分布和表達(dá)。 4．western blot方法檢測GS和pGSK-3α/β的表達(dá)情況。 結(jié)果： 1．

4、大鼠骨骼肌細(xì)胞的傳代培養(yǎng)情況良好。 2．GLP-1、INS均能促進(jìn)大鼠骨骼肌細(xì)胞的生長，GLP-1和INS聯(lián)合對大鼠骨骼肌細(xì)胞的生長有疊加作用。GLP-1組、INS組、GLP-1+INS組的OD值均明顯高于Ctrl組（P<0．05），表明GLP-1和INS聯(lián)合應(yīng)用使細(xì)胞存活數(shù)量增加，GLP-1和INS聯(lián)合應(yīng)用對細(xì)胞生長具有疊加作用。 3．免疫細(xì)胞化學(xué)法和western blot均表明：與GLP-1組比較，GLP-1+PI

5、3K阻斷劑LY294002組的GS的表達(dá)明顯減少（P<0．05），表明PI3K阻斷劑LY294002部分阻斷了GLP-1促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞GS表達(dá)增加的作用。GLP-1能誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞GS的表達(dá)增加，GLP-1促進(jìn)大鼠骨骼肌細(xì)胞糖原合成的作用與PI3K通路有關(guān)。 4．給予GLP-1刺激后，western blot結(jié)果顯示：15min和30min出現(xiàn)明顯的陽性顆粒（pGSK-3α/β）表達(dá)。與15min組比較，1h組、2h組、8h組均

6、與之有明顯差異（P<0．05），表明GLP-1作用于骨骼肌細(xì)胞使細(xì)胞內(nèi)PI3K活化，使GSK-3失活，即生成失活狀態(tài)的pGSK-3α/β。 結(jié)論： 本研究通過體外試驗(yàn)證實(shí)了GLP-1可直接作用于大鼠骨骼肌細(xì)胞通過激活PI3K通路，下調(diào)GSK-3的活性，即生成失活狀態(tài)的pGSK-3α/β，從而增加信號轉(zhuǎn)導(dǎo)下游的未磷酸化的GS的含量，未磷酸化的GS為GS的活性形式，從而增加骨骼肌中GS活性來促進(jìn)糖原合成。給予PI3K阻斷劑L